基因表达系列分析对丹皮酚胂化合物作用的人肝癌细胞HepG2基因表达的初步研究

论文摘要

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,是我国位居第二的癌症“杀手”,但现在还缺乏治疗肝癌的有效药物,研究筛选抗肝癌的药物是我国面临的重要抗癌任务。在分子肿瘤学取得迅速进展的今天,抗癌药物的筛选将由针对疾病的筛选转向针对机制的筛选,其关键是寻找可供治疗干预的特殊分子靶点,也就是找到正常细胞与癌细胞之间的生化与分子差异。因此,如果对肿瘤发生和发展的分子机制进行深入研究,试图找到一种全面分析评价抗肿瘤药物对肿瘤作用机制的方法,将为抗肿瘤药物的筛选提供一个新的策略。 本文利用LongSAGE技术,定性和定量研究丹皮酚胂化物2-甲氧基-4-羟基-5-乙酰基偶氮苯-4-胂酸（R2）对人肝癌细胞HepG2基因表达差异的影响,寻找其作用的分子靶点,探讨丹皮酚胂化物抗肝癌作用的分子机制。 以丹皮酚胂化物R2作用的人肝癌HepG2细胞作为研究对象,提取总RNA,用生物素的磁珠逆转录合成双链的cDNA,用锚定酶Nla Ⅲ酶切cDNA,将酶切的cDNA片段分成两份,分别与连接子A、B连接。用标签酶Mme Ⅰ酶切连接子和cDNA结合的序列,释放出带有连接子的标签,使用T4 DNA连接酶连接带有连接子A、B的标签,形成130bp的双标签,并进行大规模PCR扩增。锚定酶Nla Ⅲ切除连接子A、B,得到34bp双标签,再把双标签连接成串联体,最后将串联体克隆转化测序。用SAGE2000软件对序列进行分析,获得丹皮酚胂化物作用人HepG2细胞的LongSAGE标签库。将构建好的LongSAGE标签库与SAGEmap中人的肝癌组织的SAGE标签库进行比对,从而了解R2作用后人肝癌细胞基因表达差异的情况。 从构建好的LongSAGE标签库中挑选克隆45个,进行测序,测序一共得到标签675个,特异性标签为401个,其中单一匹配标签263个,占66%,多重匹配标签57个,占14%,新标签81个,占20%。在构建好的LongSAGE标签库与人的肝癌的SAGE标签库之间,基因表达存在明显差异,主要差异表达的基因有PAFAH2、MCM3、CTPS、GFM2、HSP70、TMSB4X、TXNRD1、CYP3A4、MAP2K2、SET、CASP8、OXCT1等。结果表明,R2通过下调了PAFAH2、MCM3、CTPS、GFM2、HSP70的表达,上调了TMSB4X、TXNRD1、CYP3A4、MAP2K2、SET、CASP8、OXCT1的表达而发挥着抗肝癌的作用。 SAGE方法能较完整地、定量地获得基因表达信息,识别丹皮酚胂化物抗肝癌作用的分子靶点,有助于阐明丹皮酚胂化物作用的分子机制,进一步表明丹皮酚胂化物有可能成为一种新的抗肿瘤药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.1.1 问题的提出
• 1.1.2 课题研究的意义
• 1.2 国内外研究现状
• 2抗肿瘤作用的研究现状'>1.2.1 砷剂及丹皮酚胂化物R₂抗肿瘤作用的研究现状
• 1.2.2 基因表达系列分析的研究现状
• 1.3 本文研究的目的和研究内容
• 2体外作用于HePG2细胞的实验'>2 丹皮酚胂化合物R₂体外作用于HePG2细胞的实验
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 细胞株
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 主要实验材料及配制方法
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 结果和讨论
• 2体外作用于人肝癌细胞株HepG2'>2.3.1 丹皮酚胂化合物R₂体外作用于人肝癌细胞株HepG2
• 2作用HePG2细胞数量的分析'>2.3.2 R₂作用HePG2细胞数量的分析
• 3 长标签基因表达系列分析标签库的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 细胞材料
• 3.2.3 生化试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 总RNA提取
• 3.3.2 构建LongsAGE标签库
• 3.4 结果
• 3.4.1 HepG2细胞总RNA的提取
• 3.4.2 cDNA合成与NlaⅢ酶切的有效性PCR检测
• 3.4.3 适配子与cDNA连接的PCR检测
• 3.4.4 Pyrobest TaqTM DNA聚合酶PCR扩增双标签
• 3.4.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化130bp双标签
• 3.4.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化34bp双标签
• 3.4.7 串联体的连接
• 3.4.8 转化克隆PCR检测
• 3.5 讨论
• 4 R2作用的HepG2细胞基因表达系列分析文库的构建和初步分析
• 4.1 引言
• 4.2 分析方法
• 2作用的人HepG2细胞LongsAGE标签库的构建'>4.2.1 R₂作用的人HepG2细胞LongsAGE标签库的构建
• 4.2.2 表达基因差异分析
• 4.3 结果
• 2作用的人HepG2细胞LongSAGE标签库分布状态'>4.3.1 R₂作用的人HepG2细胞LongSAGE标签库分布状态
• 4.3.2 表达基因差异分析
• 4.4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 后续研究工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录