小麦脂肪酸α-双加氧酶体外表达及在小麦中表达模式分析

论文摘要

生物在长期的进化过程中形成了一套独特的适应外界环境胁迫的生理及生化机制。这种生物适应性包括了一系列复杂的过程:如胁迫信号的受体感应、细胞间的信号传递、细胞内信号级联放大效应、基因的表达调控模式改变、胁迫后恢复正常状态的调节。在信号传递及基因表达调控方面,多不饱和脂肪酸（PUFA）及其衍生物扮演着重要的角色。如花生四烯酸途径合成的前列腺素以及白三烯等,它们与动物组织病变、癌症及炎症反应有着密切的关系。植物亚麻酸途径产生的茉莉酸（Jasmonate,JA）除了调节正常的生理活动外,还参与逆境胁迫下建立全局防御体系的信号传递。合成脂氧化物（oxylipins）等信号分子的主要代谢途径为脂肪酸的加氧反应,催化该类反应的酶统称为脂肪酸加氧酶（fatty acid oxygenase）。生物体内的加氧酶主要包括:催化哺乳动物前列腺素合成第一步反应的环氧化酶（cyclooxygenase）;催化合成白三烯等炎症物质第一步反应的脂加氧酶（lipoxygenase）;催化植物合成JA等信号物质的脂加氧酶（lipoxygenase）以及新发现的催化脂肪酸alpha氧化的双加氧酶（α-dioxygeanse）。本研究首先对克隆到的小麦脂肪酸alpha双加氧酶基因（DOX）进行原核表达,摸索了不同表达载体在不同宿主菌中的表达效率。发现使用原核表达载体pEHISTEV-DOX、pET32a-DOX在BL21（DE3）codon plus菌株中具有较高的表达量。同时也构建了能够抗2mg/mL G418浓度、整合pPIC9k-DOX的毕赤酵母表达菌株,为深入研究小麦DOX体外活性打好了基础。其次,该研究利用放射自显影技术和数据库中的EST统计分析初步分析了DOX基因在小麦中表达模式。结果显示小麦DOX基因可能具有与水稻相似的表达调控模式,即同时涉及植物的抗逆和发育两个过程。这与拟南芥具有参与抗逆的DOX1和参与发育的DOX2的分工有所区别。但是小麦是异源六倍体,其DOX的表达模式还需要进一步深入的研究。最后,本研究从白粉病胁迫的小麦叶片中同源克隆到小麦NAD+依赖型醛脱氢酶（ALDH）基因cDNA。EST统计分析,其所出现的cDNA文库和小麦DOX基因出现的cDNA文库具有很高的重叠性。从序列及表达模式上推定该基因属于脂肪酸alpha氧化循环中的Cn-1脂肪醛脱氢酶。但是ALDH真正的体外活性以及体内与DOX作用方式还需进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 哺乳动物脂肪酸加氧酶的研究进展
• 1.1.1 哺乳动物环加氧酶（COX）
• 1.1.1.1 COX1、2 的表达调控差异
• 1.1.1.2 COX1、2 的序列信息差异
• 1.1.2 脂加氧酶（LOX）
• 1.1.2.1 LOX 家族进化
• 1.1.2.2 哺乳动物LOX 的结构与分类
• 1.1.2.3 哺乳动物LOX 的表达调控
• 1.1.3 细胞色素P450 加氧酶（EPOX）
• 1.2 植物脂肪酸加氧酶的研究进展
• 1.2.1 脂加氧酶（LOX）
• 1.2.1.1 植物LOX 分类
• 1.2.1.2 植物LOX 的亚器官定位及生物学功能
• 1.2.2 脂肪酸alpha 双加氧酶（DOX）
• 1.2.2.1 DOX 的发现
• 1.2.2.2 DOX 的催化活性
• 1.2.2.3 其他植物的DOX 及研究进展
• 1.2.2.4 DOX 的生物学功能
• 1.2.2.5 DOX 血红素环境研究
• 1.2.2.6 DOX 的过氧化物酶活性
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 小麦DOX 基因大肠杆菌高效表达体系建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.1.2 主要培养基及溶液
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DOX 原核表达载体构建
• 2.2.2 DOX 原核表达
• 2.2.3 DOX 包涵体初步纯化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 DOX 原核表达载体构建
• 2.3.2 DOX 原核表达
• 2.3.3 DOX 包涵体初步纯化
• 2.4 讨论
• 第三章 小麦DOX 基因酵母表达阳性株的构建
• 3.1 材料及仪器
• 3.1.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 3.1.2 引物设计与合成
• 3.1.3 主要试剂及其配制
• 3.1.4 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 pMD18-T-DOX 中间载体构建
• 3.2.2 pPIC9k-DOX 穿梭载体构建
• 3.2.3 pPIC9k-DOX 转化酵母及阳性克隆筛选
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 pMD18-T-DOX 中间载体构建
• 3.2.2 pPIC9k-DOX 穿梭载体构建
• 3.3.3 pPIC9k-DOX 转化酵母及阳性克隆筛选
• 3.4 讨论
• 第四章 小麦DOX 基因表达模式分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要分子生物学试剂
• 4.1.3 主要试剂及其配制
• 4.1.4 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 Northern 杂交
• 4.2.1.1 植物材料处理
• 4.2.1.2 总RNA 制备及甲醛变性凝胶电泳
• 4.2.1.3 RNA 碱性转移
• 4.2.1.4 Northern 杂交
• 4.2.2 DOX 基因EST 统计分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 Northern 杂交
• 4.3.1.1 总RNA 制备
• 4.3.1.2 RNA 碱性转移
• 4.3.1.3 Northern 杂交
• 4.3.2 DOX 基因EST 统计分析
• 4.4 分析讨论
• 第五章 小麦ALDH 基因的同源克隆
• 5.1 材料及仪器
• 5.1.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 5.1.2 引物合成
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 扩增ALDH 基因引物设计
• 5.2.2 RT-PCR 扩增目的基因
• 5.2.2.1 cDNA 第一链合成
• 5.2.2.2 目的基因ALDH 扩增
• 5.2.3 ALDH 生物信息学分析
• 5.2.3.1 序列同源性分析
• 5.2.3.2 表达模式分析
• 5.3 结果讨论
• 5.3.1 RT-PCR 扩增目的基因
• 5.3.2 ALDH 生物信息学分析
• 5.3.2.1 序列同源性分析
• 5.3.2.2 小麦ALDH表达模式分析
• 5.4 讨论
• 第六章 结论和创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附表
• 作者简介