曲霉和马尔尼菲氏青霉多糖蛋白检测方法的研究

论文摘要

背景及目的侵袭性真菌感染是因机体免疫力下降引发的严重的播散性真菌感染。近30年来,随着继发性免疫功能低下（如白细胞减少症、烧伤、器官移植、HIV感染等）人群的增多、免疫抑制剂、抗肿瘤药物及广谱抗生素的大量使用、导管置管的广泛开展等,机会性真菌感染呈明显的上升趋势,较为突出的有2种真菌:曲霉（Aspergillus spp.）和马尔尼菲氏青霉（Penicillium marneffei）。发病率主要与病人的免疫力状态和暴露于危险因素（如环境中高浓度的真菌污染等）的程度有关。曲霉广泛分布于环境中,种类繁多,有200种左右,是家居环境和粮食、食品中最常见的污染真菌,严重影响人类健康。其中10种以上可以引起人类疾病,常见为烟曲霉和黄曲霉,少见的有土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉等,临床上表现为过敏性疾病和致死性的侵袭性曲霉病。而青霉中唯一的温度依赖性双相真菌——马尔尼菲氏青霉,主要引起AIDS患者和免疫力低下人群的感染。自1956年分离于越南的竹鼠以来,在东南亚国家如泰国、印度北部、我国南方省份（如广东、广西、香港、台湾）、越南等感染病例的报道逐年增加,呈明显地域性,尤其在HIV感染高发区,马尔尼菲氏青霉的感染率也明显升高。流行病学调查发现,马尔尼菲氏青霉已经成为东南亚国家AIDS患者中并发机会性感染的主要致病菌之一。上述两种真菌所导致的侵袭性感染,如侵袭性曲霉病和播散性马尔尼菲氏青霉病,病情急重,死亡率极高,据报道已经超过50%,主要原因是:（1）缺乏早期、准确的诊断;（2）抗真菌药物的毒副作用严重且耐药株不断增多。为降低感染病人的死亡率,迅速、快捷、准确的诊断对预后尤为重要。但系统性的机会性真菌感染多发生于免疫功能严重受损的病人,缺乏特异性临床表现,因此,须依赖实验室手段进行确诊。目前实验室诊断真菌感染的方法主要有:真菌培养、分子生物学技术、组织学检查和血清学诊断。（1）真菌培养是真菌感染实验室诊断的金标准,但是耗时长,周期一般4周左右。（2）虽然分子生物学方法更灵敏快速,但是需要特殊的实验室仪器设备和操作技术,并较易发生污染导致假阳性结果;而且环境中广泛存在的曲霉也为分子生物学检测增加了难度。（3）组织学检查虽然快速,但对免疫功能严重受损的患者而言创伤性极大。（4）血清学诊断则成为早期诊断真菌感染的一种合理选择。但是,由于曲霉广泛存在于周围环境中,每人每天至少吸入几百个漂浮于空气中的曲霉孢子,几乎每个健康成年人血清中均含有较高浓度的曲霉特异性抗体;血清中抗体的检测还受限于患者在严重免疫抑制状态下,无法产生足够的抗体。所以,特异性抗体检测对曲霉感染的早期诊断意义不大。虽然部分马尔尼菲氏青霉感染患者中存在特异性抗体,但研究发现特异性抗体的检出率并不高,而且在伴有马尔尼菲氏青霉感染的AIDS患者中,特异性抗原升高的水平较抗体更明显。因此,寻找特异性抗原,尤其是循环抗原,将有助于曲霉及马尔尼菲氏青霉感染的早期诊断,并可能用于HIV感染的辅助诊断。目前真菌感染早期诊断的靶标集中在真菌细胞壁成分,尤其是多糖成分。多糖（或多糖蛋白）是构成真菌细胞壁的骨架结构,也是细胞壁上的主要抗原成分,其中甘露聚糖（或甘露聚糖蛋白）含量最高。有研究发现曲霉病人血清中存在高水平的循环半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）,并以此为靶标建立的双夹心曲霉抗原检测试剂盒（Platelia Aspergillus）,在曲霉病的早期诊断中有重要价值。但检测青霉素类抗生素（例如:氨苄西林-舒巴坦,哌拉西林-三唑巴坦,阿莫西林-克拉维酸）治疗的免疫抑制病人标本时,该试剂盒的假阳性率很高,这是由于GM抗原还同时存在于其它真菌如青霉细胞壁中,从而导致临床误诊,进行不必要的抗真菌治疗。而马尔尼菲氏青霉感染却缺乏特异、灵敏的早期诊断试剂盒。因此,本研究旨在建立一种能够特异性检测并区分曲霉和马尔尼菲氏青霉感染的免疫学方法。方法及结果本研究主要包括三部分内容:第一部分:曲霉属和烟曲霉特异性多糖蛋白检测方法的研究本实验室前期研究用烟曲霉提取曲霉多糖蛋白和特异性位于烟曲霉细胞壁和分泌上清中的重组甘露聚糖蛋白（命名为Afmp1p）,分别免疫小鼠并制备针对曲霉多糖蛋白的单克隆抗体和针对Afmp1p的单克隆抗体,分别以这两组单抗配对建立两种双抗体夹心ELISA抗原捕获法。本研究进一步探讨这两种检测方法对曲霉多糖蛋白的特异性和广谱性。用这两种曲霉多糖蛋白检测方法对多种环境曲霉和临床曲霉培养上清进行检测,结果发现:用烟曲霉提取多糖蛋白免疫制备单抗建立的检测方法可广谱性检测临床、环境中的多种曲霉;而烟曲霉Afmp1p单抗建立的检测方法仅特异性检测临床和环境中的烟曲霉。且这两种检测方法与其它真菌（1株马尔尼菲氏青霉及5株念珠菌）均无交叉反应,提示两种方法分别为曲霉属广谱性和烟曲霉特异性检测方法。上述结果表明,这两种检测方法除可用于早期诊断曲霉感染,特别是烟曲霉感染,还可用于广谱检测污染环境、农作物、食品中的多种曲霉,为早期诊断曲霉病和监测环境、农作物、食品中的曲霉污染提供新的技术手段。第二部分:马尔尼菲氏青霉多糖蛋白单克隆抗体和免疫兔血清的制备及鉴定研究初步证实甘露聚糖蛋白也存在于马尔尼菲氏青霉感染患者血清中,因此可以作为早期诊断的靶标。本研究用一种从马尔尼菲氏青霉cDNA文库中克隆的甘露聚糖蛋白（命名为Mp1p）为免疫原,通过毕赤酵母系统表达该重组Mp1p多糖蛋白并免疫小鼠,取抗体效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经重组Mp1p蛋白和间接免疫荧光法筛选强阳性克隆,最终获得18株稳定分泌Mp1p蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。免疫球蛋白亚类鉴定18株单克隆抗体,10株为IgG1,3株为IgG2a,3株为IgG2b,2株为IgG。采用相互竞争抑制试验分析单克隆抗体识别抗原表位,结果显示18株单克隆抗体至少识别4个不同的抗原位点。同时用Mp1p重组多糖蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价免疫兔血清,抗体滴度达到1×10-7血清稀释度。免疫印迹和间接免疫荧光鉴定18株单克隆抗体和免疫兔血清,显示:18株单克隆抗体和免疫兔血清均仅与马尔尼菲氏青霉酵母相细胞产生阳性反应,但不结合菌丝相细胞;与环境中常见的其它3种青霉及4种临床曲霉均无交叉反应。通过对18株针对Mp1p单克隆抗体和免疫兔血清免疫学特性的研究、抗体识别抗原位点的分析以及特异性的鉴定,其结果显示这组抗体可用于建立马尔尼菲氏青霉抗原检测方法。第三部分:马尔尼菲氏青霉多糖蛋白检测方法的建立及优化采用双抗体夹心ELISA法,根据单克隆抗体识别不同的抗原表位,18株单克隆抗体和兔多抗之间进行互相配对,通过检测马尔尼菲氏青霉培养上清、超声上清及重组Mp1p多糖蛋白的灵敏度和特异性,经反复多次筛选,最终确定了以单克隆抗体1F53A7和3C10A9-Biotin组合用于构建检测方法。经方阵滴定法确定,包被抗体浓度为10μg/ml,生物素标记抗体工作浓度为1:500。建立的双抗体夹心抗原捕获法检测重组Mp1p蛋白的灵敏度为31pg/ml。用该方法进一步检测其它青霉培养上清,结果均为阴性。以上结果表明,采用抗体夹心抗原捕获法建立的Mp1p多糖蛋白检测方法具有很高的灵敏性和特异性,可为马尔尼菲氏青霉感染提供一种新的实验室诊断方法。结论综合以上三部分的研究结果,本研究的结论如下:一利用两组单克隆抗体成功建立可分别特异性检测烟曲霉和广谱检测曲霉属的免疫学方法,为曲霉病早期诊断和环境、农作物、食品中污染曲霉的监测提供新的技术手段。二成功制备了多株具有马尔尼菲氏青霉酵母相细胞抗原特异性的单克隆抗体,为免疫诊断试剂的研制、马尔尼菲氏青霉多糖蛋白生物学特性的研究以及开发马尔尼菲氏青霉治疗性抗体等奠定基础。三率先建立灵敏度高、特异性强的双单克隆抗体夹心马尔尼菲氏青霉多糖蛋白捕获ELISA法,该方法特异性针对马尔尼菲氏青霉酵母相细胞抗原,与其它青霉及曲霉均无交叉,有望用于马尔尼菲氏青霉感染的早期诊断。四利用甘露聚糖蛋白为靶标,成功的建立了区别检测曲霉和马尔尼菲氏青霉的方法,为特异性诊断曲霉和马尔尼菲氏青霉感染奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 曲霉属和烟曲霉特异性多糖蛋白检测方法的研究
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二部分 马尔尼菲氏青霉多糖蛋白单克隆抗体和免疫兔血清的制备及鉴定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三部分 马尔尼菲氏青霉多糖蛋白检测方法的建立及优化
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 成果
• 综述
• 致谢
• 统计学审稿证明