RGD修饰的PHA支架对人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

论文摘要

本研究利用PHA表面颗粒蛋白PhaP与RGD融合表达的融合蛋白PhaP-RGD修饰PHBHHx支架上,并在修饰的支架上进行人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的软骨分化实验。hBMSCs被接种于PhaP-RGD贴附的三维PHBHHx支架中,经过不添加血清的软骨分化培养液进行诱导形成软骨细胞/PHA复合物。通过CCK-8检测细胞活力,发现相比在PhaP贴附和未贴附蛋白的支架,hBMSCs在PhaP-RGD贴附的PHA支架中增殖效率明显增高。利用激光共聚焦显微镜对支架中的细胞分布进行观察,发现贴附有RGD的支架有利于骨髓间充质干细胞的均匀分布。实时荧光定量PCR检测软骨特异性基因的表达,包括sox-9,多聚蛋白聚糖,I型胶原和II型胶原。发现软骨特异性基因在PhaP-RGD组支架中呈阳性表达,且表达量明显高于对照组。最后,检测软骨特异性基质葡萄糖胺聚糖（sGAG）和总胶原（Collagen II）含量,能观察到在PhaP-RGD支架上葡萄糖胺聚糖的分泌比对照组更多,且分布更均匀。结果表明,PhaP-RGD贴附的PHBHHx支架能促进骨髓间充质干细胞的软骨分化,有希望应用于软骨的组织修复工程中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词表
• 第1章 前言
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）概述
• 1.2 PHA 颗粒表面结合蛋白的概述
• 1.3 组织工程概述
• 1.3.1 组织工程的特点
• 1.3.2 PHA 在组织工程方面的应用及前景
• 1.3.3 MSCs 在组织工程方面的应用及前景
• 1.4 软骨组织工程的概述
• 1.4.1 干细胞与软骨修复
• 1.4.2 支架材料
• 1.5 RGD 的概述
• 1.6 选题目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 常用生化试剂
• 2.1.4 常用溶液和培养基
• 2.1.5 常用仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 间充质干细胞的分离与培养
• 2.2.2 细胞表型分析
• 2.2.3 融合蛋白 PhaP-RGD 的表达
• 2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.5 蛋白质含量的测定
• 2.2.6 PHBHHx 支架制作和修饰
• 2.2.7 细胞接种
• 2.2.8 细胞软骨分化培养
• 2.2.9 扫描电镜（SEM）
• 2.2.10 细胞活力和分布检测
• 2.2.11 软骨特异基因表达分析
• 2.2.12 生化检测
• 2.2.13 统计学分析方法
• 第3章 结果和讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 干细胞表型鉴定
• 3.1.2 PhaP-RGD 融合蛋白表达和纯化
• 3.1.3 PHBHHx 支架的表征
• 3.1.4 干细胞分布和活力检测
• 3.1.5 基因表达分析
• 3.1.6 软骨特异性分泌基质分析
• 3.2 分析与讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间论文发表完成情况
• 致谢