内源光敏色素基因过量表达载体的构建及转化玉米的研究

论文摘要

玉米是我国第一大粮食作物,总产量约占全世界的30%。但是,与发达国家相比,我国玉米的单位面积还不高。如何提高玉米产量是玉米遗传育种和耕作栽培研究最主要的目标。选育推广株型紧凑的品种,合理提高种植密度是行之有效的增产措施。但是,种植密度过高,群体内光照不足,又会影响玉米的正常生长,造成倒伏、结实率降低、病虫害等一系列的问题。其中,倒伏对产量的影响最为严重,主要是由于植物的避荫性促使植株在密植条件下过度长高,茎杆纤细软弱,加之病虫危害、风雨侵袭等原因造成的。植物的避荫性受光信号转导途径调控。感受环境光信号的受体,在单子叶植物细胞内有A、B、C三类光敏色素（Phytochrome,Phy）。其中,PhyA和PhyB与避荫性的关系更为密切。本研究试图通过转基因途径,实现内源光敏色素基因的过量表达,以期通过原有光信号转导途径的修饰,改变玉米的光形态建成特性,探索改良玉米避荫性及产量相关性状的可能性。以玉米自交系B73作为材料,通过RT-PCR克隆其光敏色素基因zmPHY A1、和：zmPHY A2,两个基因全长均为3396bp,利用该序列构建单子叶植物表达载体pTU-A1及pTU-A2。首先在该序列上引入适当的酶切位点,后将扩增得到的光敏色素基因片段亚克隆至中间载体pMD-18T中,得到pMD-18T-A1/A2。再对含有BAR基因的植物表达载体pTF101.1进行改造,引入启动目的基因表达的启动子Ubiquitin以及终止目的基因表达的终止子T-nos,从而得到改造后植物表达载体pTU。并在此基础上对插入光敏色素基因的T载体pMD-18T-A1/A2及植物表达载体pTU进行适当酶切,将酶切后的光敏色素基因片段与植物表达载体pTU连接,最终得到光敏色素植物表达载体pTU-A1及pTU-A2。该载体还含有植物组成型启动子35S启动的选择标记基因Bar和大肠杆菌选择标记基因aadA农杆菌介导该表达载体转化玉米自交系“18-599R"和“18-599W"胚性愈伤组织,经三轮除草剂梯度筛选后,转PHYA1基因得到“18-599R"抗性愈伤组织,抗性愈伤组织分化培养得到再生植株192株。对转基因植株进行PCR检测获得7个阳性植株。转PHYA2基因得到“18-599R”和“18-599W”抗性愈伤组织,抗性愈伤组织分化培养“18-599R”和“18-599W”分别得到再生植株60和177株。对再生植株进行PCR检测获得5株阳性植株。对PCR检测呈阳性的植株进行授粉,对于部分PCR检测呈阳性但自身没有花粉的植株,用未转基因而同一品种材料的花粉给To代雌花授粉,获得T1代。再对T1代植株进行PCR检测,因为T1代还未纯合,需要继续鉴定并选育出纯合体,以及对转基因植株进一步作分子杂交、表达检测和耐阴性鉴定,从而培育成稳定的转基因株系。除探索转化利用内源光敏色素基因,提高玉米耐阴性的可能性外,也有助于研究光敏色素A在光信号转导系统的有关机理及作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 前言
• 1.1 光敏色素的发现
• 1.1.1 光敏色素分子及其理化性质
• 1.1.2 光敏色素的生理功能
• 1.1.2.1 光敏色素对细胞生长的调节
• 1.1.2.2 光敏色素与光周期现象
• 1.1.2.3 营养生长和生物钟
• 1.1.3 光敏色素与植物激素的协同作用
• 1.1.4 光敏色素对基因表达的调控
• 1.1.5 光敏色素与避阴性
• 1.1.6 玉米光敏色素的研究进展
• 1.2 玉米转基因的研究进展
• 1.3 选择标记基因的研究
• 1.4 光敏色素基因遗传转化的研究进展
• 1.5 本研究的方法和目的
• 第二部分 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌、质粒和引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素和激素
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 光敏色素基因zmPHY A1/A2的克隆
• 2.2.1.1 玉米总RNA的提取
• 2.2.1.3 PCR扩增全长
• 2.2.1.4 PCR产物凝胶回收
• 2.2.1.5 目的片段的连接
• 2.2.1.6 感受态细胞的制备
• 2.2.1.7 E.coli的热激转化
• 2.2.1.8 菌液PCR检测
• 2.2.1.9 质粒提取
• 2.2.2 目的片段zmPHYA1的获得
• 2.2.2.1 单酶切载体质粒pMD-18T-zmPHY A1
• 2.2.2.2 平末端化处理
• 2.2.2.3 第二步酶切并电泳回收酶切片段
• 2.2.3 目的片段zmPHY A2的获得
• 2.2.3.1 用SpeI单酶切载体质粒pMD-18T-zmPHY A2
• 2.2.3.2 平末端化处理
• 2.2.3.3 第二步酶切并电泳回收酶切片段
• 2.2.4 植物表达载体PTF101.1终止目的基因的终止子T-nos片段的获得
• 2.2.5 植物表达载体PTF101.1启动目的基因表达的玉米泛素启动子ubiquitin片段的获得
• 2.2.6 植物表达载体pTF101.1的改造
• 2.2.6.1 载体大片段的获得
• 2.2.6.2 载体大片段与终止子T-nos的连接与转化 #24连接体系如下
• 2.2.6.3 载体pTF101.1+T-nos用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切获得载体大片段
• 2.2.6.4 载体大片段与启动子Ubiqintin的连接及连接产物的转化
• 2.2.7 改造后植物表达载体（简称pTU）与目的DNA的连接和工程菌的转化
• 2.2.7.1 载体pTU用Sma Ⅰ、BamH Ⅰ分步酶切获得载体大片段
• 2.2.7.2 载体片段与目的片段的连接及工程菌的转化
• 2.2.8 胚性愈伤组织受体系统的建立
• 2.2.9 农杆菌浸染玉米愈伤组织
• 2.2.9.1 农杆菌菌株C58
• 2.2.9.2 农杆菌热击感受态细胞的制备
• 2.2.9.3 农杆菌热击感受态细胞的转化
• 2.2.9.4 转化用农杆菌的制备
• 2.2.9.5 农杆菌浸染玉米愈伤组织及共培养转化
• 2.2.10 抗性愈伤组织的筛选和植株再生
• 2.2.10.1 筛选
• 2.2.10.2 植株再生
• 2.2.11 再生植株的PCR检测
• 2.2.11.1 植物基因组DNA的提取
• 2.2.11.2 再生植株的PCR检测
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 载体构建结果与分析
• 3.1.1 目的基因zmPHY A1/A2的结果
• 3.1.2 质粒pTF101.1的改造结果
• 3.1.3 单子叶植物表达载体pTU-A1/A2的构建结果
• 3.2 再生植株的PCR检测结果与分析
• 3.2.1 抗性愈伤组织的筛选及植株的再生过程
• 3.2.1.1 筛选
• 3.2.1.2 植株再生
• 3.2.2 启动子加目的基因phyA1的PCR检测结果
• 3.2.3 启动子加目的基因phyA2的PCR检测结果
• 3.2.4 选择标记基因BAR基因的PCR检测结果
• 3.3 转基因后代T1代的PCR检测结果与分析
• 3.4 转基因玉米检测问题及结果分析
• 第四部分 讨论
• 4.1 载体构建中DNA片段的末端平滑化及平末端连接
• 4.2 过量表达玉米光敏色素zmPHY A载体的构建
• 4.3 烯效唑对植株再生的影响
• 4.4 PCR检测中污染问题及解决
• 第五部分 结论
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢