大鼠小肠移植术后HMGB1水平变化及意义初探

论文摘要

背景：小肠移植（small bowel transplantation, SBT）是治疗各种原因所导致的终末期小肠功能衰竭及短肠综合征的最有效的办法[1,2]，但与其它脏器移植进展相比，仍显缓慢。小肠移植的难点有：①排斥反应发生率高，一旦发生不易恢复；②感染严重；③肠功能恢复/慢性排斥问题[3]，而急性排斥的发生率高仍是阻碍小肠移植发展的主要因素。异体器官移植引起的复杂炎症反应和特异性免疫应答，主要由细胞因子介导，通常导致急性移植排斥和移植物损坏。因此，在移植排斥研究中，细胞因子引起人们的极大关注。高迁移率族蛋白1（High mobility group box protein-1，HMGB1）是一种普遍存在于真核细胞核中的非组蛋白核结合蛋白，是细胞核染色质的组分之一[4,5,6]。HMGB1不仅是迁移性高的核结合蛋白，更是功能强大的细胞外因子。在机体损伤和/或感染后免疫反应的发生、发展过程中起到重要作用，是组织器官损伤后炎症反应启动的“早期”炎性介质；而在机体发生致死性全身炎症反应时，又是关键的“晚期”介导因子（Latemediator）[7]，是肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）的下游治疗靶点[8]。在器官移植中，先有移植物缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury，IRI），后有免疫排斥反应发生。有研究表明，HMGB1在肾脏、心脏IRI及自身免疫疾病中发挥了重要，但HMGB1在器官移植中尤其是小肠移植中的变化和作用研究相当薄弱。本实验通过检测HMGB1在异位节段小肠移植术后大鼠血清及组织中的水平，来分析HMGB1与免疫应答之间的关系，探讨HMGB1在小肠移植术后变化原因。以及应用HMGB1拮抗剂HMGB1Abox干预接受了异基因异位节段小肠移植手术的大鼠，通过检测HMGB1水平以及与急性排斥反应相关的IL-2及TNF-α水平及病理学改变，探讨干预HMGB1对小肠移植排斥反应的保护作用及机制。目的：1.熟练掌握大鼠异位节段小肠移植动物模型的建立方法，优化建模技术及围手术期的治疗。2.通过观察大鼠小肠移植术后HMGB1水平的变化，来探讨HMGB1在小肠移植术后变化的原因、作用及意义。3.通过应用HMGB1A box蛋白干预异基因小肠移植大鼠组，检测大鼠小肠移植术后参与免疫应答的细胞因子IL-2及TNF-α水平及病理组织学变化，探讨HMGB1在小肠急性移植排斥反应的作用及机制。方法：1.选用成年近交系雄性SD大鼠与近交系Wistar/A大鼠，采用文献中所用的方法[9]，建立异位节段小肠移植模型，随机分组：A组：对照组（SD）大鼠36只，仅行开关腹及左肾切除术；B组：同基因移植对照组（供、受体均为SD大鼠）36只；C组：异基因移植未干预组（供体为SD大鼠，受体为Wistar/A）36只；D组：应用HMGB1Abox蛋白干预组（供体为SD大鼠，受体为Wistar/A）36只，给予HMGB1A box蛋白600μg/只，术后天数（Postoperative days，POD）0、3、5，腹腔注射。2.取材及检测方法：各组于术后2hr、12hr、1d、3d、5d、7d处死6只大鼠，采血分离血清，同时获取移植肠。ELISA法测定血清中的HMGB1、IL-2及TNF-α的水平，Western Blot及RT-PCR法检测移植肠中的HMGB1、IL-2及TNF-α的水平，移植肠免疫组化染色检测HMGB1的表达水平，流式细胞术检测外周血HMGB1的表达水平，同时移植肠组织切片，观察移植肠组织病理学变化，确定急性排斥反应的发生及强度。结果：1.成功地建立了大鼠异位节段小肠移植模型，熟练掌握了其建立的方法，优化了建模技术及围手术期的治疗。2.病理组织学的分析：A组术后黏膜与正常黏膜无明显差异。B组术后移植肠未见明显病理组织损伤。C组与D组在术后2hr、12hr及1d移植肠均未见急性排斥反应的病理迹象，无明显炎症反应，黏膜层可见少量淋巴细胞和浆细胞浸润。C组在POD3、5、7出现轻、中、重度急性移植排斥反应，急性排斥反应程度与随时间延长而逐渐加重；D组与C组比较，D组出现排斥反应晚，且急性排斥反应程度轻。D组在POD3及POD5急性排斥反应不明显，POD7时出现轻度的急性排斥反应。3.HMGB1的水平：A组术后血清及移植肠组织中HMGB1无明显升高。在B组中，血清HMGB1在术后12hr达高峰，POD3下降至正常水平。在C组中，血清HMGB1出现了两次高峰，分别于术后12hr及POD5时，POD7时仍高于正常，与A组比较有显著差异（P<0.05）。但移植肠组织中HMGB1的变化趋势与血清中变化趋势不同，在B组术后略有升高，但与A组比较无显著差异（P>0.05）。在C组，Western Blot检测表明移植肠组织HMGB1在POD3时开始升高，POD5时达高峰。同时在POD5时通过移植肠免疫组化染色分析及流式细胞检测移植肠组织HMGB1表达水平了也证明了这一点。4. IL-2的水平：血清IL-2的变化趋势与移植肠组织中的IL-2的变化趋势基本一致。A组及B组IL-2术后无明显变化。C组在POD3明显升高，POD5达高峰，POD7时仍高于正常水平，与其余组比较有显著差异（P<0.05）。A组及B组与C组比较，IL-2水平低，均无高峰出现。在D组IL-2也出现了一次高峰，与C组比较，出现峰值时间一致，但明显低于C组，有显著差异（P<0.05）。5.TNF-α的水平：血清TNF-α的变化趋势与移植肠组织中TNF-α变化趋势基本-α一致。B组在术后出现一次高峰，术后2hr即升高，12hr达高峰，而后下降至POD3时接近正常水平。C组于术后出现两次高峰，分别于术后12hr及POD5时，POD7时仍高于正常水平。在D组，TNF-α也出现了两次高峰，出现峰值时间一致，与C组比较明显降低，有显著差异（P<0.05）。结论：1.小肠移植术后血清HMGB1水平与移植损伤和免疫损伤有密切关系，提示小肠移植术后检测血清中HMGB1水平可能成为一个对预测小肠急性排斥反应的发生及评估急性排斥反应程度的一个潜在、有用的指标。2.本研究表明，HMGB1A box蛋白能明显抑制小肠急性移植肠排斥反应。这个结果提示我们，HMGB1在小肠移植术后可能是一个重要的损伤因子，并可能是一个潜在治疗小肠移植后组织损伤的靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 实验一 大鼠小肠移植术后 HMGB1 水平变化及原因分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 HMGB1AbOX干预小肠移植急性排斥反应
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢