端粒酶在硒拮抗镉致癌作用中的调控机制研究

论文摘要

镉是一种重要的环境污染物,广泛存在于生产环境和生活环境中,急性和慢性镉接触可以引起机体肝脏、肾脏、前列腺、睾丸以及肺等器官功能障碍。1993年镉被国际肿瘤研究中心（IARC）归类为第一类致癌物。虽然对镉的研究进行了很多,但是镉的致癌作用机制目前还不十分清楚。随着肿瘤的分子生物学研究进展,端粒和端粒酶成为近年来的研究热点之一。端粒酶能以自身RNA为模板,合成端粒重复序列。端粒酶的主要成分有端粒酶RNA（TR）、端粒酶相关蛋白1（TP1）、端粒酶逆转录酶（TERT）,其中TERT是研究端粒酶基因表达调控的主要对象。研究表明,hTERT的mRNA在多种肿瘤细胞株中高度表达,而在许多正常组织细胞内却不予表达,或者表达水平很低。端粒酶的激活与肿瘤发生密切相关,因此提示端粒和端粒酶在肿瘤发生和肿瘤细胞行为中具有重要作用。目前,端粒酶成为肿瘤细胞的分子标志物,而且是抗癌治疗的新靶点。由于hTERT受多种因素调控,而镉也可以引起TERT调控因子的改变,因而我们设想镉是否通过激活端粒酶来诱导肿瘤的发生。硒是机体必需的微量元素,在人类生命活动中发挥着重要作用。硒具有阻断和预防多类肿瘤的发生、发展以及肿瘤恶化为癌的作用。因此,了解硒的性质及其作用机制在防癌、抗癌过程中显得尤为重要。一些研究结果表明硒在降低人类癌症,特别是在胃肠道、肝脏和呼吸系统癌症发病率方面可能有着重要作用,我们选定硒来研究有两方面的意义:其一是硒本身具有抗肿瘤作用。硒可以抑制癌细胞生长及其DNA、RNA和蛋白质的合成,抑制癌基因的转录;干扰致癌物质的代谢;通过清除体内的自由基实现抗氧化作用等。其二是硒能拮抗镉的毒性作用。如拮抗镉引起的氧化应激、SCE频率和精子畸形率升高、DNA单链断裂、癌基因c-myc、c-fos和c-jun的表达增强等。但是硒能否通过影响端粒酶来拮抗镉的毒性作用,目前未见报道。因而本文通过体内体外实验,应用TRAP-PCR、RT-PCR以及免疫组织化学方法研究硒对镉转化细胞的抑制作用、镉对大鼠肝脏端粒酶的影响以及硒能否拮抗镉的作用等,为研究镉的致癌作用机制提供新的思路,为进一步了解硒的抗癌机制以及硒对镉的拮抗作用奠定基础。现将结果报告如下:本文由两部分组成:第一部分硒对镉转化16HBE细胞端粒酶活性及其调控因子影响的研究一、硒对镉转化16HBE细胞端粒酶活性和细胞凋亡率影响的研究目的:研究亚硒酸钠作用于镉转化16HBE细胞后对端粒酶活性以及细胞凋亡的影响。方法:镉转化16HBE细胞分别接触不同剂量的亚硒酸钠（0、0.625、1.25、2.5、5.0μmol/L）24h,用MTT方法检测细胞活力的改变,TRAP荧光检测端粒酶活性的改变,用流式细胞仪检测凋亡率的改变。结果:随硒剂量升高,细胞活力下降,1.25-5.0μmol/L的硒处理组与对照组差异有显著性（P<0.01）;与对照组相比几个硒处理组端粒酶活性明显降低（P<0.01）;细胞凋亡率随亚硒酸钠剂量升高而增加,1.25-5.0μmol/L硒处理组凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论:亚硒酸钠作用于镉转化16HBE细胞24h后,细胞活力降低,随硒剂量增加,端粒酶活性降低,细胞凋亡率增加。二、硒对镉转化16HBE细胞hTERT及其调控基因影响的研究目的:hTERT是端粒酶活性的限速酶,受多种因子的调节,在前面端粒酶活性改变的基础上,研究亚硒酸钠作用于镉转化16HBE细胞后观察hTERT及其调控因子的变化。方法:镉转化16HBE细胞分别接触不同剂量的亚硒酸钠（0、0.625、1.25、2.5、5.0μmol/L）24h,提取RNA,用RT-PCR方法研究hTERT和调控因子基因水平的改变。结果:镉转化16HBE细胞接触亚硒酸钠24h后,hTERT基因水平随剂量增高而降低,与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）;与此同时,c-myc基因水平也呈下降趋势,1.25-5.0μmol/L剂量组与对照组比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）;madl基因水平随剂量升高呈增高趋势,1.25-5.0μmol/L剂量组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;p53基因水平随剂量升高而降低,各剂量组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;bcl-2基因水平随剂量升高而降低,1.25-5.0μmol/L剂量组较对照组明显降低（P<0.05或P<0.01）;bax基因水平基本没有变化。结论:镉转化16HBE细胞接触0.625、1.25、2.5和5.0μmol/L的亚硒酸钠,hTERT、c-myc、p53、bcl2基因表达下降,madl表达增强,而bax表达没有明显变化。三、硒对镉转化16HBE细胞hTRF1、hTRF2基因表达的影响目的:研究亚硒酸钠作用于镉转化16HBE细胞后对人端粒重复序列结合因子1（hTRF1）和人端粒重复序列结合因子2（hTRF2）的影响。方法:镉转化16HBE细胞分别接触不同剂量的亚硒酸钠（0、0.625、1.25、2.5、5.0μmol/L）24h,提取RNA,用RT-PCR方法研究hTRF1、hTRF2基因水平的改变。结果:镉转化16HBE细胞接触亚硒酸钠24h后,各剂量组hTRF1基因水平与对照组相比没有统计学意义（P>0.05）,所有剂量组hTRF2 mRNA表达与对照组相比差异没有显著性（P>0.05）。结论:镉转化细胞16HBE接触0.625、1.25、2.5和5.0μmol/L的亚硒酸钠24h,hTRF1、hTRF2基因水平均没有变化。第二部分硒、镉及其联合作用对大鼠端粒酶活性及其调控机制影响的研究一、硒镉联合作用对大鼠肝脏细胞凋亡和端粒酶活性的影响目的:研究亚硒酸钠、氯化镉以及硒镉联合作用下对大鼠肝脏端粒酶活性以及细胞凋亡的影响。方法:健康雄性SD大鼠随机分组,每组动物5只。对照组,硒组（2.5、5和10μmol/kgNa2SeO3）、镉组（5、10和20μmol/kgCdCl2）以及硒镉联合作用组（分别用上述3个剂量的亚硒酸钠与上述3个剂量的氯化镉进行组合）。亚硒酸钠采用灌胃方式染毒,氯化镉采用腹腔注射方式染毒,染毒48h后取出肝脏,TRAP荧光检测端粒酶活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:大鼠肝脏接触亚硒酸钠48h后,端粒酶活性与对照组相比没有差别（P>0.05）,细胞凋亡率随剂量升高而增加,5、10μmol/kg硒组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;大鼠氯化镉染毒48h后,肝脏端粒酶活性和细胞凋亡率均随剂量升高而增加,3个剂量组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）;2.5μmol/kg硒+5μmol/kg镉组与5μmol/kg镉组,2.5μmol/kg硒+20μmol/kg镉组与20μmol/kg镉组比较联合染毒组比单独镉组大鼠肝脏端粒酶活性降低（P<0.05或P<0.01）,2.5μmol/kg硒+镉组细胞凋亡率虽然与对照组相比明显升高（P<0.05或P<0.01）,但与相对应的镉组比较明显降低（P<0.01）;5μmol/kg硒+镉组端粒酶活性随镉剂量升高而升高,5μmol/kg硒+10μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+20μmol/kg镉组与对照组相比差异具有显著性（P<0.05或P<0.01）,5μmol/kg硒+5μmol/kg镉组与对应的5μmol/kg镉组比较端粒酶活性下降（P<0.01）,大鼠肝脏凋亡率随镉的剂量升高而增加,5μmol/kg硒+3个剂量镉组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）,但5μmol/kg硒+10μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+20μmol/kg镉组与对应的镉组比较凋亡率下降（P<0.05或P<0.01）;10μmol/kg硒+镉组与对照组比较端粒酶活性、细胞凋亡率均升高（P<0.01）,与相应的镉组比较没有差别。结论:高剂量硒可诱导大鼠肝脏细胞凋亡增加;5～20μmol/kg镉可诱导大鼠肝脏端粒酶活性增高,细胞凋亡率增加;一定剂量的硒可拮抗一定剂量的镉诱导的端粒酶活性增高和凋亡率增加。二、硒镉联合作用对大鼠肝脏端粒酶逆转录酶及c-myc、p53表达的影响目的:研究亚硒酸钠、氯化镉以及硒镉联合作用下对大鼠肝脏TERT基因以及c-myc、p53基因和蛋白表达的影响。方法:动物染毒同第二部分第一小节,用RT-PCR和免疫组织化学方法检测基因和蛋白的表达。结果:与对照组比较,3个剂量硒组的TERT基因虽有增高,但P>0.05,10μmol/kg的硒可诱导大鼠肝脏c-myc基因和蛋白高表达（P<0.05）,10μmol/kg的硒可诱导大鼠肝脏p53基因高表达（P<0.05）,5、10μmol/kg的硒可诱导大鼠肝脏P53蛋白高表达（P<0.05或P<0.01）。3个剂量的镉组可诱导大鼠肝脏TERT、c-myc、p53基因表达升高（与对照组比较P<0.05或P<0.01）,10、20μmol/kg的镉可诱导c-Myc蛋白高表达（与对照组比较P<0.01）,3个剂量的镉组均可诱导P53蛋白高表达（与对照组比较P<0.01）。在硒镉联合作用组中,虽然3个剂量的硒均可分别使3个剂量的镉诱导的大鼠肝脏TERT mRNA表达下降,但仅在2.5μmol/kg硒+5μmol/k镉组、2.5μmol/kg硒+10μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+10μmol/kg镉组,与相应剂量的镉组比较,TERTmRNA水平降低具有统计学意义,10μmol/k硒+5、10和20μmol/kg镉联合作用组与对照组相比TERTmRNA水平均升高,与对应镉组相比无统计学意义。在硒镉联合作用组中,虽然3个剂量的硒均可分别使3个剂量的镉诱导的大鼠肝脏c-myc、p53基因和蛋白表达下降,但c-myc基因水平仅在2.5μmol/kg硒+5μmol/kg镉组、2.5μmol/kg硒+10μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+5μmol/kg镉组,与相应剂量的镉组比较具有统计学意义;p53基因水平在2.5μmol/kg硒+5μmol/k镉组、2.5μmol/kg硒+10μmol/k镉组、5μmol/kg硒+5μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+10μmol/k镉组与相应剂量的镉组比较差异具有统计学意义;c-Myc蛋白水平在2.5μmol/kg硒+10μmol/k镉组、2.5μmol/kg硒+20μmol/kg镉组和5μmol/kg硒+10gmol/k镉组与相应剂量的镉组比较差异具有统计学意义;P53蛋白水平在2.5μmol/kg硒+3个剂量镉组、5μmol/kg硒+5μmol/k镉组和10μmol/kg硒+5μmol/kg镉组与相应剂量的镉组比较差异具有显著性。10μmol/kg硒+5、10和20μmol/kg镉联合作用组与对照组相比TERTmRNA水平均升高,与对应镉组相比无统计学意义。结论:10μmol/kg硒可诱导大鼠肝脏c-myc、p53基因和蛋白表达增加;镉在一定剂量条件下可以诱导大鼠肝脏高表达TERT基因以及c-myc、p53基因和蛋白;一定剂量的硒对一定剂量的镉诱导的TERT基因,c-myc、p53基因与蛋白的表达增高具有一定的拮抗作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分:硒对镉转化16HBE细胞端粒酶活性及其调控因子影响的研究
• 一、硒对镉转化16HBE细胞端粒酶活性和细胞凋亡率影响的研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 二、硒对镉转化16HBE细胞hTERT及其调控基因影响的研究
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 三、硒对镉转化16HBE细胞hTRF1、hTRF2基因表达的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 第二部分:硒、镉及其联合作用对大鼠端粒酶活性及其调控机制影响的研究
• 一、硒镉联合作用对大鼠肝脏细胞凋亡和端粒酶活性的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 二、硒镉联合作用对大鼠肝脏端粒酶逆转录酶及c-myc、p53表达的影响
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 附录一 彩图
• 附录二 博士在读期间发表论文目录
• 致谢