人精子甘露糖受体的纯化及其肽质量指纹谱鉴定

论文摘要

受精机理是生命科学的重要理论课题,其阐明对生殖调控具有重大意义,然而受精的分子机制尤其是精卵融合机制,到目前为止并没有完全阐明,人精子甘露糖受体（Mannose receptor,MR）的提出和发现,为人类受精机制的阐明,提供了可能的途径。由于以往的研究仅在于人精子MR的分布、生化特性及生理功能几个方面,为了进一步探讨MR的分子本质,本研究采用甘露糖-琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化人精子MR,纯化蛋白采用自行制备的DMA-Biotin探针进行亲和斑点杂交试验及Western blot以鉴定其甘露糖结合活性。然后,纯化蛋白经胰蛋白酶酶切后,获得的肽段被用于MALDI-TOF-MS分析,利用Mascot搜索引擎对肽质量指纹谱进行数据库检索,其中蛋白质数据库选择SwissProt库。最后,对检索得到的蛋白进行免疫印迹鉴定。结果显示:（1）自行制备的DMA-Biotin探针经亲和斑点杂交试验证明是有效的;（2）纯化蛋白经亲和斑点杂交试验证明具有甘露糖结合活性并且有显著的特异性;（3）纯化蛋白在nonreduce条件下（上样缓冲液不含β-巯基乙醇（2-ME））进行SDS-PAGE,结果可见四条大小分别为27kDa、34kDa、72kDa和121kDa的蛋白条带,在reduce条件下（上样缓冲液含2-ME）,可见27kDa、34kda、72kDa蛋白条带,但没有121kDa条带、72kDa蛋白条带染色变浅,而27kDa蛋白条带染色加深。蛋白转膜后用DMA-Biotin探针标记,只有27kDa和72kDa蛋白具有甘露糖结合活性;（4）肽质量指纹谱鉴定27kDa、72kDa和121kDa蛋白均为人血清淀粉样蛋白P成分（SAP）前体,提示72kDa蛋白和121kDa蛋白可能是27kDa蛋白的多聚体;（5）采用抗人SAP抗体进行免疫印迹试验,证实27kDa蛋白为SAP;（6）肽质量指纹谱鉴定,34kDa蛋白为膜联蛋白（ANXA5、ANXA1、ANXA2）,但抗人ANXA5抗体的免疫印记试验表明,34kDa蛋白不是ANXA5。综上所述,得出以下结论:本研究利用甘露糖-琼脂糖凝胶亲和层析方法首次从人精子上分离到了SAP,该蛋白具有甘露糖结合活性,很可能是人精子的甘露糖受体。

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