蛋白磷酸酶PP1α和PP1γ在H1299细胞中的表达水平和抑瘤功能分析

论文摘要

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内一种普遍存在的调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程,并且在细胞信号的传递过程中占有极其重要的位置。蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应分别由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化。蛋白激酶由一个庞大的并且功能极其多样的基因家族所构成,相比之下,蛋白磷酸酶则有着较少的数量和种类。蛋白磷酸酶1（PP1）的催化亚基能与大于150种的调节亚基形成复合物,这种复合物的构造使得PP1c转变成很多不同的形态,从而具有底物特异性、独特的亚细胞定位和特异性的调节功能。这使得大量的依靠PPl的细胞功能通过独立的机制得到控制。我们以H1299为实验材料,通过运用脂质体转染的方法,建立了H1299-pCI-neo、H1299-pCI-PP1α、H1299-pLKO.1和H1299-pLKO.1-PP1α等稳定表达细胞株,通过Western Blot的方法鉴定和检测了PP1α和PP1γ的相对表达情况,我们发现：当过表达PP1α时,H1299细胞中的PP1γ的表达量出现了明显的下调,而当靶向沉默PP1α时,H1299细胞中的PP1γ表达水平则出现了明显的上调,并且,PP1β和PP1γ的表达似乎维持着总量的平衡,二者呈现出拮抗表达的关系。通过RT-PCR,我们验证了在mRNA水平也同样存在着这种关系,这说明PP1α和PP1γ拮抗表达的关系在mRNA水平就受到了严格地调控。我们还通过细胞增殖实验和裸鼠荷瘤实验,对H1299、H1299-pCI-neo、H1299-pCI-PP1α三种稳定细胞株进行了鉴定,发现过表达PP1α能明显的延缓细胞周期并抑制肿瘤细胞的生长,同时,我们也通过Western Blot检测了几种基本的周期蛋白的表达,发现CyclinA/B/E与PP1α的表达具有协同效应,而其具体的作用机制有待进一步研究验证。综上,我们可以得出以下结论：在H1299细胞中,过表达PP1α后PP1γ的表达明显下调,相反靶向沉默PP1α则PP1γ的表达明显上调,二者的表达具有拮抗关系,并维持着总量的稳定。同时过表达PP1α能够阻抑H1299细胞的生长周期的进行,具有良好的抑瘤作用效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第一节 蛋白质磷酸化与去磷酸化
• 第二节 蛋白激酶和蛋白磷酸酶
• 第三节 蛋白磷酸酶1（PP1）
• 一、蛋白磷酸酶1的结构
• 二、酶学特性和催化机制
• 三、活性调节与功能
• 第四节 本课题研究背景
• 第二章 实验材料与方法
• 第一节 实验材料
• 一、实验材料
• 二、实验仪器
• 第二节 实验方法
• 一、人肺腺癌细胞（H1299）的培养
• 二、H1299-pCI-neo和H1299-pCI-PP1α稳定细胞系的建立
• 三、H1299-pLKO.1和H1299-pLKO.1-PP1α稳定细胞系的建立
• 四、Western blot分析与鉴定
• 五、RT-PCR分析与鉴定
• 六、细胞增殖实验
• 七、裸鼠荷瘤实验
• 第三章 实验结果和讨论
• 第一节 实验结果
• 一、在H1299细胞中过表达PPlα对PP1γ表达的影响
• 二、在H1299细胞中靶向沉默PPlα对PPlγ表达的影响
• 三、mRNA水平PP1α和PP1γ的表达关系
• 四、过表达PP1α对H1299细胞增殖的影响
• 五、过表达PP1α对H1299细胞致瘤性的影响
• 六、过表达和靶向沉默PP1α对周期蛋白表达的影响
• 第二节 讨论
• 一、H1299细胞中PP1α与PP1γ表达水平的相互制约关系
• 二、H1299细胞中PP1α抑瘤作用的可能分子机制
• 参考文献
• 附录
• 致谢