降钙素原的重组、表达及单克隆抗体的制备

论文摘要

目的：在严重细菌感染性疾病的诊断中，降钙素原以其潜在的应用价值已成为应用研究热点。降钙素原（procalcitonin，PCT）是无激素活性的降钙素（calcitonin，CT）前肽物质，为含116个氨基酸的糖蛋白，半衰期为20—24小时，在体内稳定性好。在正常及健康的个体中，PCT经一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血清PCT的浓度极低，仅为10—50pg／ml，一般的方法检测不到。在系统炎症反应综合症（SIRS）、败血症、败血症休克等严重细菌感染患者的血清PCT显著升高，其浓度可达正常水平的几倍甚至上万倍，并且PCT浓度和疾病严重程度成正相关，并随着病情的发展变化而变化，因而PCT可作为诊断严重细菌感染、判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。本实验根据Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密码子，改变部分碱基序列但保持其氨基酸序列不变，采用多引物人工一步合成基因技术合成降钙素原的全长基因，并将其构建于原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达载体pGEX-4T-1／PCT，将pGEX-4T-1／PCT转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达，得到融合蛋白经纯化后进行动物免疫，用改良了的方法进行细胞融合后，采用细胞筛选方法以获得可稳定分泌鼠抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，为日后制备抗PCT单克隆抗体，制备检测PCT试剂盒，及研究PCT的来源、生理病理功能等提供了良好的实验基础。方法：根据Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密码子，改变部分碱基序列但保持其氨基酸序列不变，使目的基因能更好地在大肠杆菌中高效表达。利用引物设计软件，根据所设计的PCT的全长基因设计了18条引物，并在第一和第十八条引物分别引入BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，采用多引物人工一步合成基因技术将18条引物一次合成PCT的全长基因，以合成的全长基因为模板进行PCR扩增后构建于pMD18-T载体中，将pMD18-T／PCT转化TOP10后提取质粒经酶切鉴定并将菌液送测序。测序正确后将pMD18-T／PCT重组质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切并割胶回收目的基因，再构建于原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达载体pGEX-4T-1／PCT，将pGEX-4T-1／PCT转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达，得到了融合蛋白，与所购买的抗PCT单克隆抗体进行Western blot鉴定。融合蛋白经谷胱甘肽—S—转移酶亲和层析柱纯化，免疫Balb／c小鼠。用改良了的方法进行细胞融合后，采用细胞筛选方法得到2株可稳定分泌鼠抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为6A4、7D6。并将由杂交瘤细胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白与已纯化的PCT蛋白进行Western blot检测其特异性。结果：采用多引物人工一步合成基因技术合成PCT的全长基因，PCR扩增后构建于pMD18-T载体中，将pMD18-T／PCT转化TOP10后提取质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到了大小与预期相符的目的条带。将经酶切鉴定正确的菌株送测序，将测定的基因序列与所设计的PCT序列用0miga分析软件进行同源性分析，结果显示有一株菌株目的基因序列与所设计的PCT序列100％相符，表明重组载体中插入的序列为PCT的全长基因，插入序列中无碱基突变。将测序正确的pMD18-T／PCT重组质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切并割胶回收目的基因，再构建于原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达载体pGEX-4T-1／PCT，将pGEX-4T-1／PCT转化大肠杆菌BL21，提取质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到了大小与预期相符的目的条带。通过IPTG诱导表达，得到的融合蛋白经15％SDS-PAGE电泳鉴定在相当分子量为40 ku处有目的蛋白出现，与预期相符。将融合蛋白与所购买的抗PCT单克隆抗体进行Western blot鉴定结果显示融合蛋白与抗PCT单克隆抗体可发生特异性反应。融合蛋白经谷胱甘肽—S—转移酶亲和层析柱纯化，得到了纯度＞60％的GST-PCT蛋白。成功免疫Balb／c小鼠，得到血清效价1：20000的小鼠，采用经改良的方法进行细胞融合后，筛选得到2株可稳定分泌鼠抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为6A4、7D6。经Western blot鉴定由杂交瘤细胞株所分泌的鼠抗人PCT蛋白与己纯化的PCT抗原可发生特异性反应，与菌体蛋白不反应，特异性较强。结论：1．根据Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密码子但保持其氨基酸序列不变，使目的基因能在大肠杆菌中高效表达。2．改变传统的直接从基因库中提取目基因的方法，而改为采用多引物人工一步合成基因技术成功合成了PCT的全长基因，并得到了高效表达的GST-PCT蛋白，为制备抗PCT单克隆抗体奠定了基础。3．应用杂交瘤细胞筛选技术成功得到2株可稳定分泌鼠抗人PCT蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为6A4、7D6，经检测具有高特异性和亲和力，为严重细菌感染性疾病的诊断提供了重要手段，为深入研究PCT的来源、病理生理作用以及临床应用提供了重要工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、背景
• 二、PCT的来源
• 三、PCT的合成
• 四、PCT释放的调节
• 五、PCT的生物学作用
• 六、PCT的临床应用
• 第一部分: PCT基因的重组及鉴定
• 1. 实验目的
• 2. 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 相关试剂的配制
• 2.1.4 引物合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因序列和引物序列设计
• 2.2.2 目的基因的合成
• 2.2.3 目的基因的扩增
• 2.2.4 感受态细胞的制备
• 2.2.5 目的基因的克隆
• 2.2.6 阳性重组子的筛选
• 3. 实验结果
• 3.1 基因序列的设计
• 3.2 目的基因的扩增
• 3.3 目的基因的克隆与阳性重组子的筛选
• 4. 讨论
• 第二部分: PCT蛋白的表达及纯化
• 1. 实验目的
• 2. 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 相关试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCT目的基因片断的纯化与酶切
• 2.2.2 融合表达载体的构建
• 2.2.3 重组克隆的筛选及鉴定
• 2.2.4 重组基因的诱导表达
• 2.2.5 PCT蛋白与PCT单克隆抗体Western blot鉴定
• 2.2.6 PCT蛋白表达条件的优化
• 2.2.7 PCT蛋白的大量制备
• 2.2.8 PCT蛋白的纯化
• 3. 实验结果
• 3.1 pGEX-4T-1/PCT重组表达质粒的鉴定
• 3.2 重组质粒的表达
• 3.3 PCT蛋白与PCT单克隆抗体Western blot鉴定
• 3.4 PCT蛋白表达条件的优化
• 3.5 PCT蛋白的纯化
• 4. 讨论
• 第三部分: PCT单克隆抗体的制备
• 1. 实验目的
• 2. 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 相关试剂的配制
• 2.1.4 细胞和动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 动物免疫
• 2.2.2 配液
• 2.2.3 制备饲养细胞和脾细胞
• 2.2.4 免疫脾细胞的收集
• 2.2.5 SP2/0的准备
• 2.2.6 细胞融合
• 2.2.7 筛选
• 2.2.8 间接ELISA
• 2.2.9 蛋白特异性的鉴定
• 2.2.10 有限稀释法克隆化
• 2.2.11 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 3. 实验结果
• 3.1 动物免疫
• 3.2 杂交瘤细胞系的建立
• 3.3 蛋白特异性的鉴定
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录一: 文献综述《降钙素原的临床诊断价值》
• 附录二: 缩略词表
• 致谢
• 硕士期间论文发表情况