论文摘要
目的：帕会森病（PD）是中枢神经系统常见的一种神经退行性疾病,然而PD的发病原因还不清楚,目前认为氧化应激和细胞凋亡在帕金森病发病机制中占有重要地位。抗氧化和抗细胞凋亡方面的治疗已成为PD治疗的有效途径。硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin Reductase,TR）是一种NADPH依赖性的抗氧化酶,主要功能是催化氧化型的硫氧还蛋白转变为还原型,具有抗氧化作用。TR成员主要有三种：TR1,TR2,TR3。其中TR1是脑中主要的一种TR类型。但迄今为止,TR1在PD中脑内的作用尚不清楚。因此,本研究主要分两个部分。第一部分主要研究1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠模型中,小鼠中脑和黑质致密区（SNc）TR1蛋白表达、TR活性的变化和1-甲基-4-苯基一四氢吡啶离子（MPP+）诱导的PD细胞模型中TR1蛋白表达的变化。第二部分构建TR1真核表达载体,并将其转染PC12细胞,以观察TR1是否对PD细胞模型具有保护作用。方法：第一部分,C57BL/6小鼠随机分为两组：正常组和MPTP处理组。采用MPTP腹腔注射造模,MPTP盐酸盐（溶于生理盐水,20 mg/kg,ip）,连续注射4次,每次间隔3 h。对照组腹腔注射等体积生理盐水。MPTP诱导的PD小鼠中,测定了小鼠行为学的变化；免疫组化方法观察SNc区酪氨酸羟化酶（TH）的表达；通过比色法测定中脑氧化损伤指标：谷胱甘肽（GSH）,超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的变化；western blot方法测定中脑TR1蛋白表达水平；实时定量RT-PCR方法检测中脑TR1 mRNA水平；免疫组化方法测定SNc区TR1蛋白的表达水平：并且应用比色法测定了中脑TR的活性。PD细胞模型中,应用western blot方法测定了TR1蛋白表达水平的变化。第二部分,为了更好的研究TR1在PD中的作用,我们构建了TR1真核表达载体。载体构建方法是从PC12细胞中提取RNA,用Oligo（dT）逆转录得到cDNA,通过PCR扩增得到TR1的全长cDNA,然后TR1的全长cDNA和质粒pcDNA.3.1/myc-His（-）B-3×FLAG-IRES-hrGFP应用EcoRI和BamHI双酶切后进行连接。连接成功后,挑单克隆送公司测序。为了观察TR1是否有神经保护作用,将TR1真核表达载体转染PC12细胞,通过GFP绿色荧光蛋白观察转染效率；western blot方法检测了其在PC12细胞中的表达；应用MTT方法测定了细胞的存活率。结果：第一部分：在PD小鼠模型中,MPTP组和正常组比较：行为学显示小鼠肌张力降低；SNc区TH阳性神经细胞数目减少；中脑氧化损伤指标GSH和SOD降低,MDA升高。中脑TR1的mRNA和蛋白表达水平降低,TR活性降低；SNc区TR1阳性神经细胞数目减少。在PC12细胞模型中,MPP’组和对照组比较,TR1蛋白表达水平明显降低。第二部分：连接后的重组体通过公司测序和GeneBank比对发现我们正确克隆了大鼠野生型TR1基因的cDNA序列。将重组体转染PCI2细胞,通过荧光显微镜观察GFP蛋白的绿色荧光,发现转染效率为50%,重组体在PC12细胞中表达量明显增加。TR1重组体可以明显对抗Mpp+诱导的PC12细胞损伤,细胞存活率明显升高。结论：MPTP诱导的PD小鼠模型和MPP+诱导细胞模型中TR1表达显著降低；pcDNA.3.1/myc-His（-）B-3×FL AG-IRES-hrGFP-TR1构建成功；TR1重组体在PC12细胞中得以表达并对PC12细胞具有保护作用
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标签：帕金森病论文; 硫氧还蛋白还原酶论文; 氧化应激论文;