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吡咯喹啉醌及其酶蛋白葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

2020-12-16阅读(252)

吡咯喹啉醌及其酶蛋白葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

论文摘要

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine, PQQ）是继黄素核苷酸（FMN、FAD）和烟酰胺核苷酸（NAD、NADP）之后发现的第3种辅酶,对微生物和动植物都具有重要生理学功能,并且在食品、医药及农业等领域具有广阔应用前景。以PQQ为辅酶的醌蛋白葡萄糖脱氢酶（PQQGDH）与PQQ结合成具有活性的全酶后便能催化葡萄糖生成葡萄糖酸,而且PQQGDH在氧化葡萄糖过程中不利用氧作为电子受体,因此PQQGDH在检测葡萄糖传感器的应用方面备受关注。PQQ的生物合成涉及4-7个相关基因,这些基因一般成簇排列。不同来源的PQQ基因具有一定的同源性,并各自组成类似的Pqq基因簇。肺炎克雷伯氏菌编码PQQ的基因pqqABCDEF连续排列成1个基因簇,大小约为7K。本课题以肺炎克雷伯氏杆菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）编码PQQ基因簇作为模板,利用PQQ基因簇本身自带的Sal I酶切位点,分成2K、5K两个片段进行分段克隆分段连接,避免了大片段克隆的非特异性,最终构建成pET28a-PQQ质粒,鉴定成功后转化大肠杆菌BL21得到表达PQQ的工程菌。工程菌发酵表达后采用NBT（氧化型）-甘氨酸钾溶液非酶系统测定PQQ含量。实验以大肠杆菌BL21、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种设为空白对照,工程菌表达出的PQQ含量远高于前两者,证明了pET28a-PQQ/BL21工程菌构建成功,为接下来优化培养条件,提高PQQ产量奠定了基础。同时,以大肠杆菌BL21基因组为模板,PCR克隆出编码PQQGDH的gcd基因,与pET28a载体连接后构建成质粒pET28a-gcd。鉴定正确后将质粒转化大肠杆菌BL21,得到pET28a-gcd/BL21的工程菌。IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,结果显示此菌株高效表达了87 kDa的PQQGDH,由于基因来源和宿主属于同一种菌株,避免了因表达系统冲突而影响产量。在培养基中加入葡萄糖,工程菌的生长和PQQGDH表达量有很大提高。另外,在培养基中添加MgCl2后,PQQGDH的表达量又有所提高,将近是空白菌表达量的20倍,证明了金属离子不仅参与PQQ与其醌蛋白结合过程,同时能提高醌蛋白的产量。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 PQQ的发现
  • 1.2 PQQ的物理性质
  • 1.3 PQQ的分布
  • 1.4 PQQ的生物学功能
  • 1.4.1 PQQ作为醌蛋白的辅酶，参与呼吸链的电子传递
  • 1.4.2 PQQ是机体生长刺激因子
  • 1.4.3 调节机体自由基水平，保护机体
  • 1.4.4 促进神经生长因子产生，修复神经生长因子
  • 1.5 PQQ的生物合成
  • 1.6 PQQ的合成基因
  • 1.6.1 pqqA
  • 1.6.2 pqqB
  • 1.6.3 pqqC和pqqD
  • 1.6.4 pqqE
  • 1.6.5 pqqF和pqqG
  • 1.7 PQQ生物合成的调控
  • 1.8 PQQGDH的介绍
  • 1.9 本课题的立项意义
  • 第二章 克隆肺炎克雷伯氏菌PQQ基因并构建工程质粒
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌株与质粒
  • 2.2.2 试剂与仪器
  • 2.2.3 培养基
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 肺炎克雷伯氏杆菌肺炎亚种基因组DNA的提取
  • 2.3.2 聚合酶链式反应（PCR）扩增pqq 2K片段
  • 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因pqq 2K片段并回收
  • 2.3.4 pET-28a质粒载体的提取
  • 2.3.5 酶切连接构建质粒Ⅰ（pET28a-2K）
  • 2.3.6 转化
  • 2.3.7 菌落PCR筛选阳性克隆
  • 2.3.8 质粒Ⅰ（pET28a-2K）的酶切鉴定
  • 2.3.9 PCR扩增pqq 5K片段
  • 2.3.10 质粒Ⅰ（pET28a-2K）和5K DNA片段的酶切连接及转化
  • 2.3.11 菌落PCR筛选阳性克隆
  • 2.3.12 转化大肠杆菌BL21
  • 2.4 结果与讨论
  • 2.4.1 K. pneumoniae subsp.pneumoniae基因组DNA的提取
  • 2.4.2 PQQ 2K片段PCR扩增
  • 2.4.3 pET28a质粒提取
  • 2.4.4 酶切连接后转化
  • 2.4.5 2K片段菌落PCR
  • 2.4.6 5K片段PCR扩增
  • 2.4.7 连接转化后菌落PCR
  • 2.4.8 提取质粒单、双酶切鉴定
  • 2.5 本章小结
  • 第三章 工程菌表达PQQ的研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 菌株与质粒
  • 3.2.2 试剂与仪器
  • 3.2.3 培养基
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 工程菌诱导表达PQQ
  • 3.3.2 非酶系统测定PQQ含量
  • 3.3.3 基本培养基发酵生产PQQ
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 工程菌生成PQQ的检测
  • 3.4.2 基本培养基发酵生产PQQ的检测
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 克隆大肠杆菌gcd基因并构建工程质粒
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 菌株与质粒
  • 4.2.2 试剂与仪器
  • 4.2.3 培养基
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 Escherichia coli BL21基因组DNA的提取
  • 4.3.2 聚合酶链式反应（PCR）扩增gcd基因
  • 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定目的基因gcd片段并回收
  • 4.3.4 pET-28a质粒载体的提取
  • 4.3.5 酶切连接
  • 4.3.6 转化
  • 4.3.7 菌落PCR筛选阳性克隆
  • 4.3.8 pET28a-gcd的酶切鉴定
  • 4.4 结果与讨论
  • 4.4.1 E.coli BL21基因组DNA的提取
  • 4.4.2 gcd基因片段PCR扩增
  • 4.4.3 pET28a质粒提取
  • 4.4.4 酶切连接后转化
  • 4.4.5 2K片段菌落PCR
  • 4.4.6 提取质粒单、双酶切鉴定
  • 4.5 本章小结
  • 第五章 工程菌表达PQQGDH的研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验材料
  • 5.2.1 菌株与质粒
  • 5.2.2 试剂与仪器
  • 5.2.3 培养基
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组蛋白
  • 5.3.2 pET28a-gcd工程菌的表达条件优化
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 SDS-PAGE检测分析PQQGDH
  • 5.4.2 葡萄糖对PQQGDH表达量的影响
  • 2对PQQGDH表达量的影响'>5.4.3 MgCl2对PQQGDH表达量的影响
  • 5.5 本章小结
  • 第六章 实验总结与建议
  • 6.1 主要结论
  • 6.2 本课题创新点
  • 6.3 问题与建议
  • 参考文献
  • 附录1 试剂
  • 附录2 仪器设备
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录
  • 作者和导师简介
  • 附件

    • 相关论文文献

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