细胞色素P450的高效原核表达及应用于持久性有机污染物的检测

论文摘要

细胞色素P450是包含一个血红素蛋白的超大家族,它被发现存在于所有的生物有机体中:从细菌、酵母、真菌、植物、动物以至于人体,这个酶引人注目的特点是能够催化广泛的有机化合物的反应,能使有害物质转变成为可溶物从体内排出。因此它在各种生物合成和生物降解中起着重要的作用。本论文对家蝇细胞色素P4506A1（CYP6A1）和大鼠细胞色素P4501A1 （CYP1A1）这两个基因在大肠杆菌中克隆和表达进行了研究,表达的蛋白质进行了初步的分离和纯化,并构建生物传感器以分别用于持久性有机污染物艾氏剂、七氯和苯并芘的分析检测。在此工作的基础上,进一步研究了CYP1A1基因在烟草表达与组织定位,以用于环境中苯并芘的生物修复研究。通过PCR扩增得到CYP6A1及CYP1A1基因的ORF序列,并经过一定的改造与原核表达载体pCW连接,构建了重组载体pCW/CYP6A1和pCW/ CYP1A1,转化到大肠杆菌菌株DH5α中,并用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析表明,CYP基因的表达产物的分子量大小与预期相符,对CYP6A1及CYP1A1基因表达产物进行初步提取纯化。用表面活性剂双十八烷基二甲基溴化铵（DSAB）和双十六烷基磷酸（DHP）分别固定初步纯化的蛋白CYP6A1和CYP1A1于热裂解石墨电极表面,构建相应的生物传感器,并分别应用于其相应底物艾氏剂和七氯及苯并芘的催化氧化研究和分析检测。用植物表达载体pCANMBIA1302（含绿色荧光蛋白GFP）构建CYP1A1基因蛋白表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草中,经PCR检测得到阳性转化植株,并对其中大部分阳性植株进行RT-PCR分析其表达量。对鉴定的阳性植株进行农杆菌瞬时表达,含GFP的融合蛋白主要定位于叶片的叶脉中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语及英文对照
• 第1章 绪论
• 1.1 持续性有机污染物
• 1.1.1 持久性有机污染物特性
• 1.1.2 持久性有机污染物国际、国内研究进展
• 1.1.3 持久性有机污染物分析和处理技术的研究
• 1.2 细胞色素P450 概述
• 1.2.1 名称由来与研究历史
• 1.2.2 物种特性和体内分布
• 1.2.3 细胞色素P450 的作用原理
• 1.2.4 重要的代谢有机污染物的P450
• 1.2.5 生理功能与应用前景
• 1.3 转基因植物增强植物对有机污染物的耐受、吸收、转化和降解能力
• 1.4 本研究的目的及意义
• 第2章 家蝇细胞色素P450 6A1 的表达及纯化
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料、试剂与设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 总RNA 完整性的鉴定
• 2.3.2 RT-PCR 产物
• 2.3.3 CYP6A1 和重组质粒的限制内切酶酶切鉴定
• 2.3.4 测序结果
• 2.3.5 SDS-PAGE 凝胶分析
• 2.3.6 柱纯化蛋白检测图
• 2.3.7 紫外光谱分析
• 2.3.8 各纯化步骤的蛋白含量
• 2.4 结论
• 第3章 家蝇细胞色素P4506A1 的直接电化学及应用于有机氯杀虫剂的催化氧化研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 紫外-可见光谱
• 3.3.2 DSAB 膜内CYP6A1 的电化学行为
• 3.3.3 DSAB 膜内CYP6A1 的的催化行为
• 3.3.4 DSAB 膜内CYP6A1 的电解催化
• 3.4 结论
• 第4章 大鼠细胞色素P4501A1 的高水平表达及应用于苯并芘的安培检测研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料、试剂与设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 CYP1A1 原核表达载体的构建
• 4.3.2 CYP1A1 蛋白的提取
• 4.3.3 基于CYP1A1+的直接电化学及用于苯并芘的检测
• 4.4 结论
• 第5章 大鼠细胞色素P4501A1 基因在烟草中的特异表达及组织定位
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料、试剂与设备
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 超表达载体的构建
• 5.3.2 超表达载体的烟草转化
• 5.3.3 T0 代植株DNA 水平鉴定
• 5.3.4 候选植株RNA 水平的检测
• 5.3.5 CYP1A1-ORF 表达的组织定位
• 5.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 已发表的论文目录