锯缘青蟹内表皮N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性质研究

2020-12-03阅读(131)

论文摘要

以锯缘青蟹（Scylla serrata）内表皮为材料,经过含0.2 mol/L NaCl的10 mmol/LTris-HCl（pH 7.5）缓冲液匀浆抽提处理,硫酸铵分级盐析纯化,获得粗酶。粗酶再经过SephadexG-100凝胶层析,DEAE-Cellulose离子交换柱层析,Phenyl Sepharose柱层析,及ConA Sepharose柱层析,获得比活为668.90 U/mg的聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-Acetyl-β-D-glucosaminidase或NAGase,EC 3.2.1.52）制剂。通过Sephacryl-S 200凝胶过滤柱层析法测定该酶的分子量约为74.59 kD。该酶为糖蛋白。进一步对锯缘青蟹内表皮NAGase进行研究。化学修饰法研究表明:组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和酸性氨基酸的侧链羧基是该酶的活性功能基团,而二硫键、赖氨酸的ε-氨基和精氨酸胍基不是该酶所必需的。分别选用水体污染物（金属离子和有机溶剂）、饲料成分（氨基酸和糖）及抗菌类药物为效应物,探讨这些物质对内表皮NAGase活力的影响。1.金属离子对酶活力的影响:结果表明Mg2+对酶活力几乎没有影响;Co2+和Mn2+分别在1.0-10.0 mmol/L和0.5-20.0 mmol/L浓度范围对酶有轻微的激活作用;Al3+对酶有一定的抑制作用,当其浓度为0.54 mmol/L时,可抑制44.4%的活力;而Pb+、Cu2+和Zn2+对酶具有强烈的抑制作用,其半抑制浓度(IC50)分别为:0.4、0.05和0.04mmol/L。2.有机溶剂对酶活力的影响:结果表明甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、丙酮、甲醛、二甲亚砜、二氧六环及二甲基甲酰胺等对酶均有较强的抑制作用,其半抑制浓度(IC50)分别为:3.7、2.3、1.15、2.4、2、2.3、0.80、1.15、0.68、0.88和0.8mol/L。3.氨基酸对酶活力的影响:结果表明除L-Lys具有明显的抑制作用,L-His和L-Asp具有轻微的抑制作用外,其余的几种氨基酸对该酶均无明显的影响。导致该酶活力丧失一半的L-Lys浓度(IC50)为11 mmol/L。4.糖对酶活力的影响:结果表明当鼠李糖（rha）的浓度达0.2 mol/L,可激活酶活力约15%;0.8 mol/L的果糖（fru）、蔗糖（suc）、葡萄糖（glvu）和甘露糖（man）分别使酶的活力下降47.61%、57.54%、85.70%和90.50%;0.6 mol/L的阿拉伯糖（ara）可抑制酶41.62%的活力;0.09 mol/L的葡萄糖醛酸（glcUA）可使酶活力基本丧失;0.3 mol/L的半乳糖（gal）可抑制酶活力37.71%;而80 mmol/L的NAG可使酶丧失83%的活力。5.抗菌类药物对酶活力的影响:结果表明青霉素钾、卡那霉素和链霉素对酶活力基本没有影响;1.0-10.0 mg/ml的庆大霉素对酶有轻微的激活作用;而恩诺沙星对酶有强烈的抑制作用,使酶活力丧失一半的浓度(IC50)为2.9 mg/ml。分别以锯缘青蟹的内表皮和肝胰脏为材料,通过匀浆、离心,获chtitnase和NAGase粗酶液。通过对不同生长期锯缘青蟹chitinase和NAGase的比较研究,结果显示不同生长期锯缘青蟹内表皮的chitinase和NAGase的比活力变化趋势基本一致:比活力在第1期最高,然后依次递减,第5期达到最低,此后维持在一稳定的水平。而肝胰脏chitinase和NAGase的比活力变化趋势虽然基本一致,但并没有一定的变化规律。内表皮和肝胰脏的NAGase最适pH都在5.6-5.8,最适温度分别为42℃和40±2℃,pH稳定性分别是5.0-10.0和5.0-9.0。温度稳定性方面的研究表明内表皮NAGase在大于45℃的条件下活力逐渐丧失,肝胰腺NAGase在大于42℃。的条件下活力开始降低。通过对不同季节锯缘青蟹chitinase和NAGase的比较研究,结果表明:锯缘青蟹内表皮chitinase和NAGase活力表现一致的季节性变化趋势,活力较高的月份集中在10-12月;一年当中,3月的活力较低,此后活力逐渐升高,直至11月,活力达到最高,然后又逐渐减小。不同季节肝胰脏chitinase和NAGase的活力变化规律与与内表皮的相似。不同季节NAGase的基本酶学性质较稳定,内表皮和肝胰腺的NAGase最适pH都在5.6-5.8,最适温度分别为42℃和40±2℃,pH稳定性分别是5.0-10.0和5.0-9.0。温度稳定性方面的研究表明内表皮NAGase在大于45℃的条件下活力逐渐丧失,肝胰腺NAGase在大于42℃。的条件下活力开始降低。

论文目录

中文摘要

英文摘要

缩略词

第一章引言

1.1 锯缘青蟹的概况

1.1.1 生活习性

1.1.2 繁殖与发育

1.1.3 锯缘青蟹养殖现状与存在的问题

1.2 几丁质和几丁质酶系

1.2.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶简介

1.2.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的生理功能

1.2.3 甲壳动物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的研究情况

1.3 本课题的研究内容与研究意义

第二章实验材料、仪器与方法

2.1 材料与试剂

2.2 仪器

2.3 方法

2.3.1 锯缘青蟹和组织的获得

2.3.2 蛋白质浓度的测定

2.3.3 NAGase活力的测定和比活的计算

2.3.4 Chitinase活力的测定和比活的计算

2.3.5 内表皮NAGase的分离纯化

2.3.6 内表皮NAGase的纯度鉴定

2.3.7 内表皮NAGsae分子量的测定

2.3.8 表皮NAGase的化学修饰

2.3.9 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响

2.3.10 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响

2.3.11 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响

2.3.12 NAGase催化反应的动力学性质研究

2.3.12.1 NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数测定

2.3.12.2 NAGase催化反应最适pH的测定

2.3.12.3 NAGase催化反应最适温度的测定

2.3.12.4 NAGase催化反应pH稳定性的测定

2.3.12.5 NAGase催化反应温度稳定性的测定

第三章实验结果

3.1 内表皮NAGase的分离纯化

3.2 内表皮NAGase的纯度鉴定

3.3 内表皮NAGase分子量的测定

3.4 内表皮NAGase的化学修饰

3.4.1 DTT对酶的化学修饰

3.4.2 BrAc对酶的化学修饰

3.4.3 NBS对酶的化学修饰

3.4.4 EDC对酶的化学修饰

3.4.5 醋酸酐对酶的化学修饰

3.4.6 乙酰丙酮对酶的化学修饰

3.5 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响

3.5.1 金属离子对NAGase活力的影响

3.5.1.1 几种阴离子对内表皮NAGase活力的影响

3.5.1.2 几种金属离子对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2 有机溶剂对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.1 醇类物质对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.2 丙酮对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.3 甲醛对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.4 二甲亚砜对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.5 二氧六环对内表皮NAGase活力的影响

3.5.2.6 二甲基甲酰胺对内表皮NAGase活力的影响

3.6 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响

3.6.1 氨基酸对内表皮NAGase活力的影响

3.6.2 糖类对内表皮NAGase活力的影响

3.7 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响

3.8 不同生长期内表皮NAGase活力与性质的比较

3.8.1 不同生长期内表皮NAGase活力的比较

3.8.2 不同生长期内表皮NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数的比较

3.8.3 不同生长期内表皮NAGase最适pH和pH稳定性的比较

3.8.4 不同生长期内表皮NAGase最适温度和温度稳定性的比较

3.8.5 不同生长期内表皮chitinase活力的比较

3.9 不同生长期肝胰脏NAGase活力与性质的比较

3.9.1 不同生长期肝胰脏NAGase活力的比较

3.9.2 不同生长期肝胰脏NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数的比较

3.9.3 不同生长期肝胰脏NAGase最适pH和pH稳定性的比较

3.9.4 不同生长期肝胰脏NAGase最适温度和温度稳定性的比较

3.9.5 不同生长期肝胰脏chitinase活力的比较

3.10 不同季节内表皮NAGase活力与性质的比较

3.10.1 不同季节内表皮NAGase活力的比较

3.10.2 不同季节内表皮NAGase最适pH和pH稳定性的比较

3.10.3 不同季节内表皮NAGase最适温度和温度稳定性的比较

3.10.4 不同季节内表皮chitinase活力的比较

3.11 不同季节肝胰脏NAGase活力和性质的比较

3.11.1 不同季节肝胰脏NAGase活力的比较

3.11.2 不同季节肝胰脏NAGase最适pH和pH稳定性的比

3.11.3 不同季节肝胰脏NAGase最适温度和温度稳定性的比较

3.11.4 不同季节肝胰脏chitinase活力的比较

第四章讨论

4.1 内表皮NAGase的分离纯化与部分性质的研究

4.2 内表皮NAGase的化学修饰

4.3 效应物对内表皮NAGase活力的影响

4.3.1 水体污染物对内表皮NAGase活力的影响

4.3.2 饲料成分对内表皮NAGase活力的影响

4.3.3 抗菌类药物对内表皮NAGase活力的影响

4.4 不同生长期锯缘青蟹NAGase活力与性质的比较

4.5 不同季节锯缘青蟹NAGase活力与性质的比较

第五章结论

参考文献

硕士研究生期间发表的学术论文

致谢

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