论文题目: 重组人血管抑素的制备及其作用特异性的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 陶永辉
导师: 金坚
关键词: 血管抑素,包涵体,胰腺癌
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:制备具有满足临床应用所需纯度和生物学活性的重组人血管抑素(rhAS),并研究其对血管内皮细胞作用的特异性。方法:转化pQE30(Angiostatin)至大肠杆菌E. Coli(M15)得到表达rhAS的基因工程菌(E.Coli M15/pQE/AS),并对其发酵条件进行优化;对rhAS包涵体纯化、变性复性等条件进行优化研究并鉴定其纯度;制备得到的rhAS在人微血管内皮细胞(HMEC-1)、鸡胚尿囊膜(CAM)及荷人胰腺癌裸鼠模型上进行其生物学活性及体内药效学评价;建立测定人血浆血管抑素的ELISA方法并进行初步应用;采用流式细胞术(FCM)、rhAS-Sepharose 4B亲和层析、99Tcm标记显像、放射自显影及组织形态学分析等技术对HMEC-1细胞、S180肿瘤和Matrigel模型等进行了rhAS的受体及其作用特异性的系列研究。结果:经转化的基因工程菌可由IPTG诱导表达rhAS,其最佳发酵条件为菌体A600nm为0.8~1.0时进行诱导,加入诱导剂IPTG的终浓度为0.1mmol/L,加入诱导剂后培养时间为6h。rhAS包涵体纯化的最佳方法为:0.2%脱氧胆酸钠→去离子水→2 mol/L Gu·HCl;rhAS变性复性最佳条件为:按1:10(w/v)加入变性缓冲液(8 mol/L Gu·HCl,15 mmol/L DTT),然后将Gu·HCl变性液按1:15(v/v)加入缓冲液稀释,再按1:10(v/v)对含GSH(1mmol/L):GSSG(0.1mmol/L)氧化还原对的缓冲液进行透析复性。rhAS既可抑制HMEC-1细胞的增殖,也可诱导其凋亡;可明显抑制CAM上血管的生成和有效地抑制人胰腺癌的生长。建立了可行的测定人血浆血管抑素的ELISA方法。采用rhAS-Sepharose 4B亲和层析法得到了一系列HMEC-1细胞上的rhAS结合蛋白,其中ATP合酶α/β亚基及Actin为AS受体。HMEC-1细胞、S180肿瘤及Matrigel模型均可特异地结合rhAS。结论:通过对基因工程菌发酵条件、rhAS包涵体纯化、变性复性等条件的优化研究,得到了一条得率高,成本低,方法简便,产品生物活性高,并可规模化放大的rhAS制备工艺。亲和甑别技术的建立为研究其它药物的相关细胞受体提供了一个可行的平台。HMEC-1细胞、S180肿瘤及Matrigel模型与rhAS的特异结合表明rhAS对新生血管具有作用特异性。
论文目录:
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列图
英文缩略词
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 立题背景
1.2 血管抑素国内外研究近况
1.2.1 血管抑素的分子结构及生成机制
1.2.2 血管抑素的作用机制
1.2.2.1 血管抑素的结合分子
1.2.2.2 血管抑素的靶细胞
1.2.3 血管抑素的应用进展
1.3 立题意义
1.4 主要研究内容
第二章 重组人血管抑素的表达纯化及复性研究
2.1 前言
2.2 材料
2.2.1 菌种和质粒
2.2.2 培养基
2.2.3 主要材料
2.2.4 主要试剂
2.2.5 主要仪器
2.3 方法
2.3.1 重组人血管抑素(rhAS)的原核表达
2.3.1.1 CaCl_2 法制备感受态细胞
2.3.1.2 质粒pQE30(Angiostatin)的转化
2.3.1.3 rhAS 的表达及优化
2.3.1.4 rhAS 的制备
2.3.2 重组人血管抑素(rhAS)的生化鉴定
2.3.2.1 rhAS 表达的SDS-PAGE 分析
2.3.2.2 Western-blot 鉴定
2.3.3 重组人血管抑素的复性纯化
2.3.3.1 rhAS 包涵体的纯化
2.3.3.2 rhAS 包涵体的变性及复性优化
2.4 结果与讨论
2.4.1 rhAS 的表达及优化
2.4.2 包涵体纯化及rhAS 复性优化
2.5 本章小结
第三章 重组人血管抑素的生物学活性研究
3.1 前言
3.2 材料
3.2.1 细胞株
3.2.2 培养基
3.2.3 材料
3.2.4 主要试剂
3.2.5 主要仪器
3.3 方法
3.3.1 rhAS 对HMEC-1 细胞抑制试验
3.3.1.1 HMEC-1 细胞及L-02 细胞的培养
3.3.1.2 MTT 法测定rhAS 对HMEC-1 的抑制
3.3.2 rhAS 诱导HMEC-1 细胞凋亡试验
3.3.3 鸡胚尿囊膜(CAM)试验
3.3.3.1 鸡胚制备
3.3.3.2 给药方法
3.4 结果与讨论
3.4.1 rhAS 对HMEC-1 细胞抑制试验
3.4.2 rhAS 诱导HMEC-1 细胞凋亡试验
3.4.3 鸡胚尿囊膜(CAM)试验
3.5 本章小结
第四章 重组人血管抑素的药效学研究
4.1 前言
4.2 材料
4.2.1 细胞株
4.2.2 培养基
4.2.3 实验动物
4.2.4 主要试剂
4.2.5 主要仪器
4.3 方法
4.3.1 荷人胰腺癌裸鼠模型的建立
4.3.2 荷人胰腺癌裸鼠模型的干预研究
4.3.3 荷人胰腺癌裸鼠模型的组织形态学分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 荷人胰腺癌裸鼠模型的建立
4.4.2 荷人胰腺癌裸鼠模型的干预试验
4.4.3 荷人胰腺癌裸鼠模型的组织形态学分析
4.5 本章小结
第五章 重组人血管抑素ELISA 检测方法的建立及初步应用
5.1 前言
5.2 材料
5.2.1 动物
5.2.2 材料
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要仪器
5.3 方法
5.3.1 ELISA 检测方法的建立
5.3.1.1 兔抗-rhAS 的制备
5.3.1.2 ELISA 检测方法的建立
5.3.2 ELISA 检测方法的应用
5.4 结果与讨论
5.4.1 兔抗-rhAS 的制备
5.4.2 血管抑素ELISA 检测方法的建立
5.4.3 血管抑素ELISA 检测方法的应用
5.5 本章小结
第六章 重组人血管抑素作用特异性的研究
6.1 前言
6.2 材料
6.2.1 细胞株
6.2.2 培养基
6.2.3 实验动物
6.2.4 材料
6.2.5 主要试剂
6.2.6 主要仪器
6.3 方法
6.3.1 流式细胞术(FCM)
6.3.1.1 缓冲液
6.3.1.2 FITC 标记rhAS 及兔抗-rhAS
6.3.1.3 流式细胞术细胞准备
6.3.1.4 流式细胞术测量
6.3.2 亲和层析法纯化HMEC-1细胞上rhAS结合分子
6.3.2.1 缓冲液
6.3.2.2 rhAS-Sepharose 48 亲和柱的制备
6.3.2.3 HMEC-1 细胞的裂解
6.3.2.4 亲和层析法纯化HMEC-1 细胞上rhAS 结合分子
6.3.2.5 SDS-PAGE 鉴定
6.3.2.6 质谱测序分析
6.3.3 rhAS 结合分子的信息学分析
6.3.3.1 蛋白跨膜预测
6.3.3.2 蛋白相互作用分析
6.3.4 Tubulin 的作用分析
6.3.5 rhAS 的~(99)Tc~m标记
6.3.5.1 Na~(99)Tc~mO_4 的制备
6.3.5.2 ~(99)Tcm-rhAS 的制备
6.3.5.3 三氯乙酸(TCA)沉淀法测定标记率
6.3.5.4 质量控制
6.3.6 小鼠体内生物学分布
6.3.7 小鼠S180 肿瘤模型显像、放射自显影及组织形态学分析
6.3.7.1 小鼠S180 肿瘤模型的建立
6.3.7.2 小鼠S180 肿瘤模型显像
6.3.7.3 小鼠S180 肿瘤放射自显影
6.3.7.4 小鼠S180 肿瘤组织形态学分析
6.3.8 大鼠Matrigel 模型显像及组织形态学分析
6.3.8.1 大鼠Matrigel 模型的建立
6.3.8.2 大鼠Matrigel 模型显像
6.3.8.3 大鼠Matrigel 模型组织形态学分析
6.3.9 小鼠Matrigel 模型放射自显影及组织形态学分析
6.3.9.1 小鼠Matrigel 模型的建立
6.3.9.2 小鼠Matrigel 模型放射自显影
6.3.9.3 小鼠Matrigel 模型组织形态学分析
6.4 结果与讨论
6.4.1 流式细胞术(FCM)
6.4.2 亲和层析法纯化HMEC-1 细胞上rhAS 结合分子
6.4.3 质谱测序分析
6.4.4 rhAS 结合分子信息学分析
6.4.5 Tubulin 的作用分析
6.4.6 ~(99)Tc~m-rhAS 的制备
6.4.7 小鼠体内生物学分布
6.4.8 小鼠5180 肿瘤模型显像
6.4.9 小鼠5180 肿瘤放射自显影及组织形态学分析
6.4.10 大鼠Matrigel 模型显像及形态学分析
6.4.11 小鼠Matrigel模型放射自显影及形态学分析
6.5 本章小结
参考文献
总结
主要创新点
博士研究生期间发表论文
致谢
附录Ⅰ
附录Ⅱ
附录Ⅲ
附录Ⅳ
发布时间: 2006-12-13
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