茶多酚在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞粘附分子表达改变中的作用

论文摘要

目的动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）是一种血管壁应对各种引起粥样硬化因素的特殊类型慢性炎症。在AS的发生发展过程中，会出现多种细胞因子、炎症介质、脂质和纤维成分的增加，当它们的数量积聚到一定程度时，即会出现临床心脑血管病变。细胞粘附分子（cell adhesion molecules，CAMs）是一类调节细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间相互结合，起粘附作用的糖蛋白，它们在动脉粥样硬化斑块中的表达水平和动脉粥样硬化的发生发展过程相一致，并被认为参与了动脉粥样硬化性疾病的发病过程。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是一种含硫氨基酸，在高浓度作用下可导致白细胞粘附及游出血管内皮层，其已被证实是AS的独立危险因素。茶多酚（Tea Polyphenols，TP）是从绿茶中提取的多酚类化合物复合体，它有多种药理作用，表现出广泛的生物活性。大量研究表明，其具有抗氧化、预防心血管疾病等作用。本实验将病理生理浓度的Hcy作用于人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），观察了Hcy对HUVEC的生长抑制作用，并通过在蛋白质水平和mRNA水平粘附分子和氧化相关蛋白的检测和分析，探讨同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞粘附分子的表达增加进而促进动脉粥样硬化发生的机制，在此基础上研究茶多酚能否抑制Hcy引起的粘附分子表达，探讨其发挥药理学作用的机制，为茶多酚进一步广泛应用于临床提供实验依据。寻找有效降低动脉粥样硬化发生的干预措施，并为茶多酚的进一步研究和应用提供科学依据。方法复苏后HUVEC置于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。将处于对数生长期的HUVEC分为对照组和三个实验组：茶多酚组、Hcy组、Hcy+茶多酚组。茶多酚和Hcy在培养体系中的终浓度分别为25mg／L和5mmol／L，对照组加入等体积的PBS。加入茶多酚和Hcy培养24h后，采用四唑盐（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法测定细胞活性，分别采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及Westernblotting、免疫细胞化学方法分析粘附分子ICAM-1和E-selectin的表达。反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测ICAM-1和E-selectin mRNA水平的改变以及脂质过氧化产物丙二醛（MaleicDialdehyde，MDA）、血管舒张因子一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、一氧化氮合酶（NOS）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-PX）水平的测定。结果1．细胞形态学观察镜下可见，HCY组细胞数量最少，形态最不规则、体积增大、立体感最差；TP组与HCY组细胞相比，细胞数量增多、体积减小、立体感增强、形态规则，细胞内颗粒减少，但与正常组相比，仍有一定差别。2．茶多酚和Hcy对细胞生长的影响HUVEC给予Hcy和／或茶多酚处理24h后，MTT法测定细胞增殖情况，结果显示，Hcy可明显抑制HUVEC的生长（36.0％，P＜0.05），加入茶多酚后则明显降低Hcy所致的细胞生长抑制（7.9％，P＞0.05）。3．SDS-PAGE及Western blot方法检测粘附分子ICAM-1和E-selectin的表达与对照组相比，Hcy组细胞ICAM-1和E-selectin表达分别升高30％和34％（P＜0.05）。同时给予茶多酚后，ICAM-1和E-selectin表达分别降低16％和30％（P＜0.05）。4．免疫细胞化学法检测粘附分子ICAM-1和E-selectin的表达ICAM-1和E-selectin表达主要都是在细胞表面或细胞外基质处，对照组中ICAM-1和E-selectin染色均较浅；Hcy组中细胞虽然数量减少，且发生了形态学方面的改变，但其染色相对仍较多较重，与对照组相比，Hcy组细胞ICAM-1和E-selectin表达分别升高30％和37％（P＜0.05）；茶多酚与Hcy共同培养后，ICAM-1和E-selectin表达分别下降了17％和24％（P＜0.05）。5．RT-PCR检测粘附分子ICAM-1和E-selectin的mRNA水平的变化Hcy能显著升高HUVEC ICAM-1 mRNA水平（67％，P＜0.01），升高E-selectin mRNA水平较大417％（P＜0.01）。茶多酚与Hcy共同作用以后，ICAM-1 mRNA水平降低了37％（P＜0.01），E-selectin mRNA水平降低44％（P＜0.01）。6．MDA、NO、NOS和GSH-PX浓度的测定与对照组相比，Hcy组培养液中MDA含量增加（P＜0.05）、NO含量降低（P＜0.05）、NOS活性降低（P＜0.05）和GSH-PX浓度变化不明显（P＞0.05）；加入茶多酚后，与Hcy组相比，培养液中MDA含量降低（P＜0.05）、NO含量升高（P＜0.05）、NOS活性升高（P＜0.05）但GSH-PX浓度变化不明显（P＞0.05）。结论1．病理生理剂量的Hcy可抑制细胞生长，并使细胞发生形态学改变。2．Hcy诱导HUVEC中ICAM-1和E-selectin的表达升高，这与mRNA水平改变有关。3．Hcy诱导HUVEC中ICAM-1和E-selectin的表达升高，也与蛋白质水平改变有关。4．茶多酚对Hcy诱导的HUVEC形态学改变有抑制作用。5．茶多酚对Hcy诱导的HUVEC粘附分子ICAM-1和E-selectin表达改变有一定的逆转作用。6．茶多酚对Hcy组HUVEC培养液中MDA含量升高、NO含量降低、NOS活性降低有逆转作用，但对GSH-PX活性影响不大。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 论文正文
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文目录
• 攻读学位期间参加的主要科研项目
• 学位论文评阅及答辩情况表