（广州市番禺区慢性病防治站检验科广东广州511400）
【摘要】目的：比较结核分支杆菌耐药菌株与临床敏感株在蛋白种类上的差异，构建不同耐药结核分枝杆菌蛋白指纹图谱，为进一步研究结核杆菌耐药的分子调控机制提供依据。方法：利用高效液相质谱非标记的方法(LC-MS)鉴定耐药结核分支杆菌蛋白质类型，通过与临床敏感株比对，构建耐药结核分枝杆菌蛋白指纹图谱分析。结果：与临床敏感组相比阿米卡星耐药组有856种差异性蛋白被发现，其中显著上调的有332种，明显下调的524种；与临床敏感组相比利福平耐药组有726种差异蛋白，其中有441种明显下调，285种明显上调。阿米卡星耐药组与利福平耐药组相比有141种差异性蛋白被发现，其中下调67种，上调74种。结论：耐多药结核杆菌与临床敏感结核分枝菌株在蛋白种类与表达水平存在明显差异。
【关键词】结核分枝杆菌；耐药；LC-MS；蛋白指纹图谱
【中图分类号】R392.11【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）02-0221-03
LC-MSanalysisofproteinfingerprintofdrugresistanceofmycobacteriumtuberculosisGuoZhixing,JiangMinhui,LiJingzhong.
DepartmentofClinicalLaboratory,PanyuInstituteofChronicDisease,Guangzhou,511400,China
【Abstract】ObjectiveToanalyseProteinfingerprintclassificationandthesituationofdrugresistanceofmycobacteriumtuberculosis,whichcanprovideamolecularregulatorymechanismforfurtherstudymycobacteriumtuberculosisdrugresistance.MethodsUsingHighPerformanceLiquidChromatographyMassSpectrometry(LC-MS)identificationofthetagdrug-resistantmycobacteriumtuberculosisproteintype,throughthesensitivestrainsandclinicalcomparison,buildthedrug-resistantmycobacteriumtuberculosisproteinfingerprintanalysis.ResultsComparedwithclinicalsensitivegroupofamikacinresistantgrouphas856kindsofdifferentproteinwasfound,whichsignificantlyincreasesthereare332species,clearcutin524.AndclinicalsensitivephaseBillyrifampicinresistancegrouphas726kindsofdifferentproteins,thereare441speciesofclearcut,285kindsofraisedobviously.Amikacinresistantandrifampicinresistancegroupcomparedwiththe141kindsofdifferentproteinwerefound,whichcut67species,74kindsofraised.ConclusionProteininexpressiondifferenceswerediscoveredbetweenmulti-drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolateanddrug-sensitiveisolate.
【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis;Drugresistance;LC-MS;Proteomicfingerprint
1.研究背景
WHO最新统计数据表明，全球目前约有20亿人感染结核分支杆菌，占全世界总人口的近1/3，其中活动性肺结核患者达2000万[1-3]。平均每年新发病例约600万，绝大部分位于发展中国家。结核病的死亡率位于各类疾病之首，其广泛流行对全球经济、社会发展及进步构成严重威胁[4]。我国是世界上22个结核病高负担国之一，肺结核年新发患者和患病总人数仅次于印度，居世界第2位。目前，我国结核杆菌感染者约5亿，活动性结核患者约500万，其中涂阳患者150万。据统计显示，有近60%的传染性肺结核患者未被发现，使传染源不能得到有效控制[5]。早发现、早诊断、选取敏感的抗结核药物联合治疗是有效控制结核病蔓延的关键手段。
近年来，随着生物、化学、软件开发领域的交叉发展，数据库的积累，越来越多的新型诊断方法开始走进临床诊断，尤其是蛋白标志物的诊断，其中HighPerformanceLiquidChromatographyMassSpectrometry（HPLCMS）已经成为一种逐渐被认可的疾病标志物筛查方法[6-7]。本文通过LC-MS的方法对近年来广州地区结核分枝杆菌耐药状况以及耐药结核分枝杆菌的蛋白指纹图谱进行分析，从而为制定本地区结核病预防、诊断、控制策略提供一定的理论依据。
2.实验部分
2.1菌株来源
选取2016年８月-2017年3月在广州市番禺区慢病防治站检查疑似肺结核的住院患者100例。其中男性患者65例，女性患者35例，评价年龄为42.6岁。从100例患者痰液中分离出全部菌株，菌株进行菌型鉴定和药敏试验。菌型鉴定和药敏试验：分枝杆菌培养、鉴定和耐药性检测按照《结核诊断实验室检验规程》进行，药敏试验采用比例法进行确认。
2.2材料
缓冲液：50mMNH4HCO3（pH7.8）；碘乙酰胺溶液：55mM碘乙酰胺，50mMNH4HCO3；50%乙腈溶液：50mMNH4HCO3，50%乙腈；酶解液：12.5ug/mL胰酶，20mMNH4HCO3；色谱级乙腈，甲醇，异丙醇，甲酸购自CNW公司。DTT，IAM，NH4HCO3，Trypsin购自生工生物。实验用水为milipore超纯水。酸性罗氏培养基及分枝杆菌药敏罗氏培养管购买于珠海贝索有限公司。
2.3样本前处理
鉴定后得到30例临床敏感株，阿米卡星、利福平单耐药菌株各30例。7H9培养基培养50mL菌株（OD=0.8），7000rpm速率低温离心10min，收菌。弃上清，菌体用10mL裂解液洗两遍（50mMTris（pH7.0），150mMNaCl和0.5mMPMSF），2mL裂解液重悬。Fastprep-24裂菌，离心收上清16000g低温离心20min。收上清用，收上清用0.22μm滤膜过滤两次，90份样本低温保存。
每份样本加入200μL碘乙酰胺溶液，室温避光30min，进行蛋白烷基化；加入500μL加50%乙腈溶液，静置5min，重复二次；加入纯乙腈500μL，静置5min，重复二次；将管中乙腈吸干，氮气吹干；加入100μL胰蛋白酶酶解液，4℃放置2h，37℃水浴过夜；6000rpm离心10min，吸取上清保存在4℃冰箱，待检测。
2.4LC-MS上机分析
色谱条件：色谱仪（EasynLC1200），色谱柱（C18colum3μm，75μm×15cm），流动相（A：0.1%FAinH2O；B，0.1%FAinACN）；分析流速为300nL/min；流动相梯度：
质谱条件：
ESI源，扫描方式：ESI+模式，毛细管电压：1.4kV和1.3kV，锥孔电压：40V和23V，离子源温度：120℃，脱溶剂气温度：350℃，锥孔气流量：50L/h，脱溶剂气流量：600L/h，碰撞能量（10～40V），离子能量：1V，每0.2s采集1次图谱；准确质量测定采用芦丁溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围：50～1500m/z。
2.5数据分析
采用仪器自带MS数据处理软件ThermoProteomeDiscoverer（Thermo公司），完成样本中成分提取及数据预处理，包括基线过滤、峰识别和积分，保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属等分析。最后生成多肽信息，在蛋白质数据库中进行比对分析。
3.实验结果
3.1菌群的分离培养
100份患者痰标本经前处理后，接种于酸性罗氏培养基培养6周，挑选阳性菌群。阿米卡星、利福平单耐药诱导耐药结核杆菌各30例，诱导20代。临床敏感株30例MTB1～30，阿米卡星单耐药菌株30例AKM1～30，利福平单耐药菌株30例RFP1～30。全部菌株通过高速离心、裂解进行蛋白提取。
3.2非标记LC-MS蛋白鉴定
蛋白质非标记定量技术是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量[8]。如图1所示，非标记定量方法的原理是以MS1为基础，计算每个肽段信号在LCMS色谱上的积分，这个也是本报告所采用的Maxquant算法的原理。
其中主动脉夹层外周血相对于临床敏感组，阿米卡星、利福平单耐药结核分枝杆菌差异性最大的蛋白分别是转录调控蛋白。这一方法可以为不同耐药结核分枝杆菌蛋白指纹图谱提供一个新方法，也有助于进一步揭示结核分枝杆菌的耐药机制。
4.讨论
当前结核分枝杆菌耐药的机制普遍认为是由染色体基因突变引起的，对于各种临床药物异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺等抗结核药物的耐药菌株研究有大量报道[10-12]。大量研究发现，耐药结核分枝杆菌的靶基因均有突变痕迹。然而，目前并非全部耐药菌株都可以检测到位点突变情况，所以结核分枝杆菌的耐药机制有可能涉及到多组学的调控，尤其是蛋白水平的调控。
本文，通过与临床敏感株进行对比，得到了一系列阿米卡星、利福平单耐药结核分枝杆菌差异性蛋白，这些差异性蛋白主要集中在转录调节蛋白与延伸因子。临床敏感组相比阿米卡星耐药组有856种差异性蛋白被发现，利福平耐药组有726种差异蛋白。并且，我们发现不同耐药组分也存在大量差异性蛋白，阿米卡星耐药组与利福平耐药组相比有141种差异性蛋白被发现，这说明不同耐药菌株的生长调控机制可能差异很大。我们发现了上百种差异性蛋白，这将为不同耐药结核分枝杆菌蛋白指纹图谱的建立提供一个新方法。
5.致谢
本文由广东省科技计划项目（粤科规财字[2015]110号）支持。
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