Japanese Encephalitis Virus HW株全基因组分析及DNA疫苗的构建

论文摘要

本研究以武汉地区分离到的日本乙脑病毒HW株（Japanese Encephalitis Virus,JEV/HW）为材料,对JEV/HW全基因组进行了分段克隆、测序、拼接,最后获得了包含10个基因的全长基因组DNA序列,这10个基因为:C、PrM、E、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5,在Gen Bank上注册号为AY849939。构建了包括JEV/HW在内的19株JEV的分子进化树。并将扩增到的JEV/HW的E基因及NS1基因构建了原核表达质粒,并进行了JEV/HW NS1基因的原核表达,同时构建了JEV/HW E基因和NS1基因的真核表达基因疫苗。 序列比较分析发现:HW株与其他18株全基因组JEV病毒同源性为88.7%-99.3%。HW株与KV1899株同源性最低（88.7%）,与P3株同源性最高（99.3%）,推测的蛋白比较分析发现,同源性在97.0%-99.4%,HW株与KV1899株同源性最低（97.0%）,与P3株同源性最高（99.4%）,利用计算机软件构建了包括JEV/HW在内的19株JEVW分子进化树,综合分析可以推断HW株为P3衍生株。 在序列分析的基础上,构建了两个原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NS1蛋白。同时以pCDNA3.1为真核表达载体,构建了JEV/HW的基因疫苗pCDNA3.1-E和pCDNA3.1-NS1,两种基因疫苗经扩增纯化后可直接用于免疫动物,进行免疫源性试验,为下一步JEV/HW基因疫苗的研制打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 日本乙脑病毒的发现
• 1.2 日本乙型脑炎的危害及流行
• 1.3 JEV的分类及分型
• 1.4 日本乙脑的诊断与防治
• 1.5 日本乙脑病毒的分子生物学
• 1.5.1 日本乙脑病毒的分子结构
• 1.5.2 日本乙脑病毒的侵染与复制
• 1.5.3 日本乙脑病毒的结构蛋白
• 1.5.4 日本乙脑病毒的非结构蛋白
• 1.6 日本乙脑病毒的毒株和减毒株
• 1.7 日本乙脑病毒的疫苗
• 1.7.1 JEV灭活疫苗
• 1.7.2 JEV减毒活疫苗
• 1.7.3 JEV亚单位疫苗
• 1.7.4 JEV重组活病毒疫苗
• 1.8 日本乙脑病毒的DNA疫苗
• 1.8.1 DNA疫苗作用机理
• 1.8.2 日本乙脑病毒的DNA疫苗
• 2 本研究的内容、目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 毒株、菌株与质粒
• 3.2 培养基
• 3.3 酶及其它试剂
• 3.4 主要溶液及配制
• 3.4.1 碱裂解法制备质粒DNA用试剂
• 3.4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用试剂
• 3.5 大肠杆菌感受态的制备
• 3.6 质粒的小量制备
• 3.7 病毒活化
• 3.8 JEV RNA模板的制备
• 3.9 引物设计和合成
• 3.10 RT-PCR扩增
• 3.11 PCR产物的快速回收（V-gene Biotechnology limited DNA Gel extraetion Kit）
• 3.12 PCR产物与载体的连接
• 3.13 克隆载体的转化
• 3.14 重组质粒的筛选与鉴定
• 3.15 测序及序列分析
• 3.16 原核表达载体的构建
• 3.17 细菌的诱导表达
• 3.18 JEV DNA疫苗的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 JEV/HW株病毒的活化与扩增
• 4.1.1 用乳鼠脑组织活化与扩增病毒
• 4.1.2 用细胞系活化与扩增病毒
• 4.2 JEV/HW株病毒各基因片段的扩增
• 4.2.1 JEV/HW株病毒各基因片段扩增策略
• 4.2.2 JEV/HW株病毒各基因片段扩增结果
• 4.3 全长的JEV/HW株病毒基因组分析
• 4.3.1 全长的JEV/HW株病毒与P3株及其它18株JEV病毒核昔酸变异的比较
• 4.3.2 全长的JEV/HW株病毒与P3株编码氨基酸变异的比较
• 4.3.3 19株全长的JEV株病毒分基因组子进化树的分析
• 4.4 原核表达载体的构建与表达
• 4.4.1 原核表达载体的构建策略
• 4.4.2 原核表达载体重组子的鉴定
• 4.4.3 原核表达
• 4.5 JEV/HW株DNA疫苗的构建
• 5 讨论
• 5.1 JEV/HW株分子背景对预防JEV的意义
• 5.2 JEV/HW株保守序列分析
• 5.3 JEV/HW株与JEV/P3株亲缘关系分析
• 5.4 JEV遗传进化的探讨
• 5.5 JEV/HW病毒培养方法的探讨
• 6 结论及创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录