苍白杆菌531漆酶的基因克隆、异源表达、蛋白纯化和酶学性质研究

论文摘要

漆酶（EC1.10.3.2）是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族成员之一,它能催化酚类和芳香类化合物的氧化,使之生成相应的苯醌,同时伴随电子的转移,将分子氧还原成水。漆酶广泛存在于植物和真菌中,最近在某些昆虫和细菌中也不断发现有漆酶的存在。本实验室已从土壤中筛选到的一株产漆酶菌Ochrobactrum sp.531,但产酶量较低,本研究拟从该产漆酶菌的基因组中克隆出编码细菌漆酶的基因,在大肠杆菌表达系统中大量表达,分离纯化后进行酶生化性质和酶反应动力学测定,为后续运用蛋白质工程的方法改造酶的催化活力和稳定性打好基础。同时为了细菌漆酶的规模化生产,本研究还将采用酵母表达系统以期望实现细菌漆酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。由细菌漆酶铜结合位点保守氨基酸设计简并引物扩增出部分漆酶基因,依据翻译的部分蛋白序列BlastP搜索GenBank上的细菌多铜氧化酶,发现人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi）基因组序列中存在编码多铜氧化酶的基因。从构建细菌漆酶进化树看出,苍白杆菌属（gi153011149）和近缘物种布鲁氏菌属（Brucella）多铜氧化酶基因同源,两者漆酶在N端和C端的10个氨基酸几乎一致,结合其核苷酸序列分析设计了首尾的简并引物克隆到了全长的编码基因。该基因编码533个氨基酸,漆酶蛋白富含甘氨酸（9.76%）、丙氨酸（10.51）、亮氨酸（8.82%）、天冬氨酸（7.88%）,分子量为57.8kDa,蛋白的等电点（pI）为5.58。SingalP预测前面30个氨基酸为信号肽序列。将克隆的细菌漆酶基因插入到细菌表达载体pET23a质粒上,转化细菌宿主细胞BL21（DE3）plysS并进行表达。用Ni离子亲和层析方法纯化,从1L细菌培养物中可纯化出8mg纯净的酶蛋白。研究分析发现,酶的最适反应温度为37℃,在pH6.5时稳定性最好,在pH3.0和pH9.5的缓冲液中孵育16h后仍有60%的活力。同时该酶热稳定性较好,以4℃处理的酶为对照,80℃处理30分钟、65℃处理1h还有超过40%的活性。以DMP为底物时该酶的最适反应pH为8.0,以ABTS为底物时该酶的最适反应pH为3.6,以SGZ为底物时该酶的最适反应pH为7.5。利用Lineweaver-Burk双倒数法作图,求得Ochrobactrum sp.531细菌漆酶在pH8.0、37℃条件下催化DMP氧化反应的Km值为8.98-10-5mol/Lkcat值为7.94s-1,kat/Kmm值为8.84×104mol-1·s-1;在pH3.6、37℃条件下催化ABTS氧化的Km值为7.22×10-5mol/L, kcat值为2.95s-1,kcat/Km值为4.09×104mol-1·s-1;在pH7.5,37℃条件下催化SGZ氧化的Km值为1.49×10-Smol/L,Kat值为2.40s-1,kcat/Km值为1.61×105mol-1·s-1。由Kat/Km值可见,531细菌漆酶对底物的特异性由高到低依次为：SGZ, DMP, ABTS。对表达条件经一系列摸索后发现,在20℃下用0.5mmol/L IPTG诱导7h的表达效果较佳。麦芽糖结合蛋白（Maltose binding Protein, MBP）将极大提高漆酶的可溶性表达,而添加物山梨醇、甜菜碱和甘氨酰甘氨酸对可溶性表达没有很明显的效果。将苍白杆菌531漆酶基插入酵母分泌型表达载体PHBM905a,通过电转化将线性化的重组载体插入到毕赤酵母GS115,通过测定酵母上清液的酶活力筛选到2株酶活力较高的重组菌株。以正交设计进行诱导的条件的优化,在20℃,PH6.8和甲醇浓度为0.8%时,诱导培养4天酶活力可以达到3300U/L.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词与符号
• 第一章 文献综述
• 1 漆酶的来源
• 1.1 植物漆酶
• 1.2 真菌漆酶
• 1.3 细菌漆酶
• 2 漆酶的理化特性
• 2.1 漆酶的基本特征
• 2.2 漆酶反应底物
• 2.3 漆酶酶活测定
• 3 漆酶基因的克隆和特征分析
• 3.1 漆酶基因的克隆
• 3.2 漆酶基因序列分析
• 4 漆酶基因的表达
• 4.1 原核表达
• 4.2 真核表达
• 5 漆酶的结构特征
• 5.1 漆酶的三维结构
• 5.2 底物结合
• 5.3 催化氧化反应机理
• 6 漆酶的功能
• 6.1 植物漆酶的功能
• 6.2 漆酶与病原菌毒力
• 6.3 细菌漆酶的功能
• 7 漆酶的应用
• 7.1 环境保护
• 7.2 造纸工业
• 7.3 食品工业
• 7.4 纺织工业
• 7.5 生物传感器
• 7.6 医药卫生
• 7.7 生物合成
• 8 细菌漆酶研究的目的及意义
• 第二章 实验研究
• 1 实验仪器,材料与试剂
• 1.1 菌株和载体
• 1.2 引物设计
• 1.3 主要仪器与设备
• 1.4 主要试剂
• 1.5 所用培养基及配制
• 1.6 主要溶液及其配制
• 2 实验方法
• 2.1 从Ochrobactrum sp.531基因组DNA中克隆编码细菌漆酶的基因
• 2.2 Ochrobactrum sp.531漆酶基因在大肠杆菌中的表达
• 2.3 Ochrobactrum.sp.531漆酶的分离纯化
• 2.4 酶学性质和酶动力学常数的测定
• 2.5 Ochrobactrum sp.531漆酶的可溶性表达
• 2.6 Ochrobactrum sp.531漆酶在毕赤酵母中的分泌表达
• 3 实验结果与分析
• 3.1 Ochrobactrum sp.531漆酶的克隆
• 3.2 Ochrobactrum sp.531漆酶基因的原核表达
• 3.3 531漆酶蛋白的纯化
• 3.4 531漆酶酶学性质测定
• 3.5 531漆酶在大肠杆菌中的可溶性表达
• 3.6 Ochrobactrum sp.531漆酶在毕赤酵母中的分泌表达
• 第三章 讨论与展望
• 1 小结
• 2 讨论
• 3 展望
• 参考文献
• 致谢