荔枝果肉多酚抗氧化应激作用及其机制研究

论文摘要

荔枝具有较高的营养价值和滋补功效,被视为“果中珍品”。现代研究表明,荔枝具有抗氧化、延缓衰老、调血脂、护肝等作用,但对其物质基础和作用机理缺乏了解。研究表明植物多酚是是新鲜果蔬降低癌症发病率等多种保健作用的重要物质基础。目前对荔枝多酚的研究主要集中在其果皮中多酚在保鲜中的作用方面,对果肉多酚还很少涉及。为了了解荔枝果肉多酚的组成及活性,本文采用分部萃取法研究了各极性部分多酚组成及抗氧化活性；利用拘束应激模型,研究了荔枝多酚提取物对应激小鼠血清、肝功能、肝脏氧化还原状态、肝脏线粒体功能以及线粒体膜电位变化的影响及其可能的机制。主要研究结果如下：1荔枝多酚不同极性多酚含量及其抗氧化活性比较：分别选用60%乙醇和80%丙酮从荔枝果肉中提取多酚,并用乙酸乙酯、正丁醇和水三种不同极性溶剂对所得的多酚提取物进行分部萃取,采用DPPH法、FRAP法和ABTS法比较了荔枝果肉不同极性多酚的体外抗氧化活性差异。结果表明,采用80%丙酮提取的荔枝果肉多酚提取物的ABTS抗氧化活性显著强于60%乙醇提取物的（P<0.05）,而二者之间的总酚含量差异不显著；多酚提取物中不同极性分部的总酚得率以水部最高,乙酸乙酯部最少,但乙酸乙酯部的抗氧化活性显著性高于其他分部（P<0.05）。采用HPLC法测定了各分部的分类化合物组成及含量,从乙酸乙酯部、正丁醇部和水部分别检测出11种、9种和5种酚类物质,各种酚类物质含量均以乙酸乙酯部为最多。2 LPE改善小鼠氧化应激状态作用的研究：采用拘束负荷18h诱发小鼠氧化应激,研究了灌胃给予低（0.20g/kg bw）、中（0.40g/kg bw）、高（0.80g/kg bw）剂量的荔枝多酚提取物（LPE）对拘束负荷小鼠氧化应激状态的改善作用。用赖氏法测定小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）活性和谷氨酸氨基转移酶（AST）活性,应用市售试剂盒测定血清和肝脏MDA含量、超氧化物岐化酶（SOD）活性,测定了肝脏中黄嘌呤氧化酶（XOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性以及谷胱甘肽（GSH）含量和总抗氧化能力（T-AOC）等指标。结果表明：LPE可以降低拘束负荷引起的小鼠血清AST、ALT活性增高（P<0.05）；一定剂量的LPE对缓解拘束负荷引起的氧化应激,增加小鼠血清和肝脏中SOD活性,减少MDA生成,增加肝脏中GSH-Px等抗氧化酶活性和GSH含量有显著性作用,并呈现剂量依赖关系（P<0.05）。3 LPE改善小鼠氧化应激状态作用的机制探讨：利用分子生物学和生物化学方法,从线粒体功能角度解析上述动物实验处理中荔枝多酚提取物抗氧化应激作用的机制：采用荧光分光光度法检测Na+-K+-ATPnase活性和呼吸链复合酶活性,采用流式细胞术检测肝组织线粒体膜电位水平,采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测肝脏中琥珀酸脱氢酶复合体相关基因（SDHA-D）表达的变化。结果表明：摄入一定剂量的LPE对拘束负荷引起的小鼠肝线粒体损伤有保护作用,线粒体活性氧（ROS）的含量较模型组显著降低（P<0.01）,使线粒体升高的膜电位恢复至正常水平。LPE处理组小鼠总ATP酶活性较模型组显著升高（P<0.05）；高剂量LPE组小鼠肝线粒体呼吸链复合酶Ⅱ和Na+-K+ATP酶活性较模型组显著升高（P<0.01,P<0.05）,各组间肝线粒体呼吸链复合酶Ⅰ和Mg2+ ATP酶活性及线粒体呼吸链复合酶Ⅱ相关基因SDHA、B、C、D表达无差异。上述研究结果表明：荔枝果肉酚类物质主要集中在乙酸乙酯部,灌胃给予一定剂量的荔枝果肉多酚对拘束负荷引起的小鼠氧化应激有保护作用,该作用与其保护线粒体结构和功能有关。本文的创新点与以往仅利用单一溶剂提取后测定总酚含量不同,本研究通过分部萃取对比研究了荔枝果肉多酚不同极性分部中的多酚组成、含量及其抗氧化活性,对荔枝果肉多酚有了更清楚的了解。与以往单纯测定受试动物体内氧化-还原相关物质含量及酶活性不同,本研究从肝线粒体结构及其呼吸链相关酶表达和活性水平揭示荔枝果肉多酚的抗氧化活性机制,为荔枝的保健作用机理研究提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1 荔枝的研究进展
• 1.1 荔枝种质资源
• 1.2 荔枝的营养保健功能
• 2 酚类物质的研究概况
• 2.1 多酚类物质的结构、性质及种类
• 2.2 已开发的植物多酚
• 2.2.1 茶多酚
• 2.2.2 苹果多酚
• 2.2.3 葡多酚
• 2.3 多酚类化合物的提取分离
• 2.4 多酚的测定
• 2.5 多酚类物质的生理活性
• 2.5.1 抗氧化活性
• 2.5.2 抗癌作用
• 2.5.3 预防心血管疾病发生
• 2.5.4 抑菌作用
• 2.5.5 其他
• 3 氧化应激及其研究现状
• 4 研究目的、意义
• 5 主要研究内容
• 第二章 荔枝果肉不同极性分部多酚含量及抗氧化活性比较
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器设备
• 1.2 材料
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 荔枝果肉多酚粗提物的制备
• 1.3.2 荔枝果肉多酚不同极性分部的分离
• 1.3.3 多酚含量的测定
• 1.3.4 DPPH自由基清除率的测定
• 1.3.5 FRAP法测定总抗氧化能力
• 1.3.6 ABTS·+自由基清除率的测定
• 1.3.7 酚类物质组成及含量的测定
• 1.3.7.1 样品前处理
• 1.3.7.2 色谱条件及测定方法
• 1.3.7.3 标准品溶液配制
• 1.3.7.4 单体酚定性与定量分析
• 1.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不同荔枝果肉多酚提取物的总酚含量和抗氧化能力
• 2.2 不同极性分部的得率和总酚含量
• 2.2.1 不同极性分部的得率
• 2.2.2 不同极性分部的多酚含量
• 2.3 不同极性分部对DPPH·的清除能力
• 2.4 不同极性分部的FRAP总抗氧化能力
• 2.5 不同极性分部对ABTS·的清除能力
• 2.6 不同极性分部多酚组成和含量
• 3 讨论
• 3.1 不同荔枝果肉多酚提取物的总酚含量和抗氧化活性
• 3.2 不同极性分部的抗氧化活性和多酚含量
• 第三章 荔枝果肉多酚提取物改善拘束应激小鼠氧化应激状态
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 荔枝多酚提取物制备
• 1.1.3 动物与分组
• 1.2 动物饲养及处理
• 1.3 检测指标及方法
• 1.3.1 肝组织匀浆液的制备与蛋白质含量测定
• 1.3.2 血清ALT、AST、SOD活性及MDA含量测定
• 1.3.2.1 血清ALT、AST的测定
• 1.3.2.2 血清SOD活性的测定
• 1.3.2.3 血清MDA的测定
• 1.3.3 肝脏-TAOC、XOD、SOD、GSH-Px、CTA活性及MDA、GSH含量测定
• 1.3.3.1 肝脏总抗氧化能力T-AOC的测定
• 1.3.3.2 肝脏XOD活性的测定
• 1.3.3.3 肝脏GSH-Px活性的测定
• 1.3.3.4 肝脏CAT活力的测定
• 1.3.3.5 肝脏GSH含量的测定
• 1.3.3.6 肝脏SOD活力的测定
• 1.3.3.7 肝脏MDA含量的测定
• 1.4 数据处理和统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠一般情况
• 2.2 小鼠血清ALT、AST活性
• 2.3 小鼠血清和肝脏SOD活性
• 2.4 小鼠血清和肝脏MDA含量
• 2.5 小鼠肝脏GSH含量和GSH-Px活性
• 2.6 小鼠肝脏XOD、CAT活性和T-AOC
• 3 讨论
• 3.1 LPE缓解小鼠肝脏的损伤
• 3.2 LPE改善小鼠氧化应激状态
• 第四章 LPE改善小鼠氧化应激状态的机制探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 试剂
• 1.2 实验材料
• 1.3 肝脏线粒体的提取
• 1.4 线粒体内ROS测定
• 1.5 ATP酶活性的测定
• 1.6 线粒体呼吸链复合体酶活性测定
• 1.7 詹纳斯绿染色法检测线粒体功能
• 1.8 流式细胞术测定线粒体膜电位ΔΨM
• 1.9 基因表达检测
• 1.9.1 引物设计
• 1.9.2 琼脂糖凝胶制备
• 1.9.3 总RNA提取
• 1.9.3.1 RNA的提取操作
• 1.9.3.2 RNA质量及浓度测定
• 1.9.4 First-strand cDNA合成
• 1.9.5 PCR反应
• 1.10 数据处理和统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠肝脏线粒体内ROS含量
• 2.2 小鼠肝线粒体ATP酶活性
• 2.3 小鼠肝脏线粒体呼吸链复合体酶活性
• 2.4 小鼠肝脏线粒体功能
• 2.5 小鼠肝脏线粒体膜电位
• 2.6 RNA浓度
• 2.7 琥珀酸脱氢酶相关基因RT-PCR扩增结果
• 2.8 RT-PCR结果
• 2.8.1 小鼠肝组织管家基因β-actin mRNA表达的影响
• 2.8.2 小鼠肝组织琥珀酸脱氢酶SDH相关基因表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 拘束应激模型的建立
• 3.2 线粒体膜电位和ATP酶活的变化
• 3.3 荔枝果肉多酚保护拘束小鼠线粒体功能
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录