细胞珠蛋白在肝纤维化中的抗氧化作用及上调机制研究

论文摘要

细胞珠蛋白（Cytoglobin,Cygb）是一种新近发现的含血红素辅基的六配位球蛋白,本课题组前期研究发现Cygb具有预防肝纤维化、实现肝纤维化逆转的功能,且其作用是通过调控HSC的激活状态实现的,与肝脏中细胞及细胞外基质间的氧化应激密切相关。在此基础上,本论文选取了两种肝脏中有代表性的氧化模型:过氧化氢模型及铁过载模型,系统性研究了Cygb在肝纤维化氧化应激中发挥的具体作用,并结合microRNA（miRNA）技术,初步探索了Cygb在肝星状细胞激活时表达上调的可能性机制。论文在构建肝纤维化氧化应激体外模型并利用基因工程手段成功纯化出重组Cygb蛋白的基础上,证实不同剂量的过氧化氢或Fe-NTA/AA刺激时,无论是重组Cygb蛋白还是Cygb基因转染都能对人肝星状细胞及人肝细胞产生显著的保护作用。重组Cygb蛋白对胞内的活性氧清除效果不理想,可能与其进出细胞缺乏相应的主动运输机制有关;基因转染Cygb质粒则对胞外及胞内的氧化刺激均有较好的清除作用。利用特异性siRNA干扰人肝星状细胞内的Cygb mRNA后会使细胞对过氧化氢及Fe-NTA/AA造成的损伤更加敏感,印证了Cygb在肝星状细胞内的表达是其应对氧化应激的保护性措施。进一步对原代肝星状细胞（rHSC）的研究证实在过氧化氢作用下重组Cygb蛋白对rHSC能发挥显著保护作用;在Fe-NTA/AA作用下,Cygb蛋白能够起到抑制rHSC细胞过度增殖以及保护其被过度损伤的作用。为找出Cygb在激活态肝星状细胞中表达上调的机制,本论文引入最近发现并兴起的转录后调控机制——miRNA。利用多种miRNA靶基因分析软件预测得出5个可能靶向大鼠Cygb基因的miRNA。芯片结果证实这5个miRNA在HSC激活时表达水平总体下调,表明miRNA可能参与HSC中Cygb的转录后调控。进一步将这一方法推及到HSC激活标志基因以及Col1a1相关miRNA的预测中,分析得到8个可能调控HSC激活标志基因的miRNA和8个可能调控Col1a1的miRNA,并结合实验确定miR-29家族能够下调LX-2细胞中的Col1a1表达,建立了一种确定肝星状细胞中特定miRNA功能的有效方法。本论文为全面阐释Cygb这一治疗基因的抗氧化作用及机制、加速药物新靶点开发提供了理论依据。

论文目录

• 论文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 纤维化细胞与肝纤维化
• 0.1.1 HSC
• 0.1.2 其它Myo 祖细胞
• 0.1.3 其他肝纤维化相关细胞
• 0.2 细胞因子和信号传导及肝纤维化
• 0.2.1 TGF-β/Smad 信号途径
• 0.2.2 增殖信号途径
• 0.2.3 MAPK 信号
• 0.2.4 NF-κB（neuclear factor κB）
• 0.2.5 瘦素（leptin）信号途径
• 0.3 基质重塑和肝纤维化
• 0.3.1 细胞外基质
• 0.3.2 ECM 调节
• 0.3.3 肝纤维化的基质重塑
• 0.4 氧化应激与肝纤维化
• 0.4.1 氧化应激在不同病因肝纤维化中的作用机制
• 0.4.2 氧化应激对肝脏不同细胞的作用机制
• 0.4.3 氧化应激与ECM 合成
• 0.5 肝纤维化治疗
• 0.5.1 针对肝实质细胞及纤维化细胞
• 0.5.2 基于细胞因子和信号通路的分子治疗
• 0.5.3 ECM 靶向治疗
• 0.5.4 抗氧化治疗
• 0.6 细胞珠蛋白与肝纤维化
• 1 肝纤维化氧化应激体外研究模型建立
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品与耗材
• 1.1.2 仪器
• 1.2 溶液配制及实验方法
• 1.2.1 溶液配制
• 1.2.2 实验方法
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 质粒提取与鉴定
• 1.3.2 细胞特性观察
• 1.3.3 体外转染条件优化
• 2O₂ 模型'>1.3.4 H₂O₂模型
• 1.3.5 Fe-NTA+AA 模型
• 1.4 小结
• 2 Cygb 在人肝纤维化氧化应激中的作用
• 2.1 材料
• 2.1.1 药品与耗材
• 2.1.2 仪器
• 2.2 溶液配制及实验方法
• 2.2.1 溶液配制
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 质粒提取与鉴定
• 2.3.2 Cygb 蛋白制备
• 2.3.3 Cygb 蛋白对细胞氧化应激的作用
• 2.3.4 Cygb 基因转染对细胞氧化应激的作用
• 2.4 小结
• 3 重组 Cygb 蛋白对 rHSC 氧化应激的保护作用
• 3.1 材料
• 3.1.1 药品与耗材
• 3.1.2 仪器
• 3.2 溶液配制及实验方法
• 3.2.1 溶液配制
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 大鼠肝星状细胞（rHSC）分离
• 3.3.2 rHSC 纯度鉴定
• 3.3.3 Cygb 蛋白对rHSC 保护作用：过氧化氢损伤
• 3.3.4 Cygb 蛋白对rHSC 的保护作用：Fe-NTA/AA 损伤
• 3.4 小结
• 4 Cygb 在激活态 HSC 中表达上调的机制 ——Microrna 表达差异
• 4.1 材料
• 4.1.1 药品与耗材
• 4.1.2 仪器
• 4.2 溶液配制及实验方法
• 4.2.1 溶液配制
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Cygb 相关miRNA 预测
• 4.3.2 Collal 相关 miRNA 预测
• 4.3.3 HSC 激活标记基因相关miRNA 预测
• 4.3.4 rHSC 激活前后miRNA 芯片分析
• 4.3.5 miRNA 功能验证
• 4.4 小结
• 结论
• 创新点
• 附录（缩写）
• 参与撰写专著
• 参考文献
• 致谢