绿粘帚霉和球孢白僵菌原生质体制备、再生和融合条件的研究

论文摘要

绿粘帚霉（Gliocladium virens）是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，球孢白僵菌（Beauveria vuillenun）是绿色环保型生物杀虫菌，两者的原生质体融合属于不同属之间的原生质体融合，随着生物技术和基因工程的深入发展，不同属之间的原生质体融合频频获得成功，这为绿粘帚霉和球孢白僵菌原生质体融合提供了可行性。本文拟以绿粘帚霉F051（以下简称F051）和球孢白僵菌为出发菌株，试图通过用PEG6000作为助融剂使处于对数生长期的F051和球孢白僵菌的原生质体融合，结合抗药性及灭活单一亲本的方法在选择性再生培养基上筛选出具有治病和杀虫双重作用的生防工程菌，实验结果如下：1、F051和球孢白僵菌采用菌丝干重法测定生长曲线，结果显示，F051培养20h后进入对数生长期，一直持续到28h，而球孢白僵菌培养70h才进入对数生长期，并且持续到80h才结束。2、利用单因素实验探讨F051和球孢白僵菌原生质体产量和再生的最佳条件，结果是：（1）F051：用培养基A培养F051分生孢子24h，MgSO40.6 mol／L（再生用蔗糖0.6 mol／L），磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液为缓冲系统，纤维素酶：蜗牛酶：溶菌酶=4mg／mL：2 mg／mL：2 mg／mL，在32℃水浴中酶解2h。（2）球孢白僵菌：用L—broth培养基培养球孢白僵菌分生孢子78h，KCl 0.8 mol／L（再生用蔗糖0.6 mol／L），柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液为缓冲系统，纤维素酶：蜗牛酶：溶菌酶=5mg／mL：2.5 mg／mL：2.5mg／mL，在32℃水浴中酶解3h。3、选用7种农药分别对F051和球孢白僵菌进行抗药性测定，鉴于F051和球孢白僵菌对多菌灵敏感程度差别较大，最终选择多菌灵作为抗性鉴定用农药，并确定120μg／mL多菌灵浓度为标记浓度。4、对球孢白僵菌原生质体进行热灭活处理，并测定了温度和时间两个因素对致死率的影响，结果表明，55℃以上水浴中处理90min，65℃水浴中处理60min以上都会使原生质体全部失活不能再生出任何菌落，最后我们选择55℃处理90min作为失活条件。5、测定了标记浓度和热灭活条件分别对F051和球孢白僵菌出发菌株原生质体突变率的影响，排除了突变株对融合菌株的干扰。6、对融合子再生培养基进行了初筛，最后确定用改良的YEPD培养基为融合子再生培养基。7、以30％PEG6000+0.01mol／LCaCl2作为助融剂，在32℃水浴中进行融合，在显微镜下观察到了原生质体融合的现象，以改YEPD含药培养基为选择性再生培养基，但无再生菌落长出，可能原因有：（1）PEG分子量太大，浓度太高，对融合子有毒害作用；（2）融合子不稳定；（3）融合子再生率低。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 原生质体及融合技术的研究现状
• 1.1.1 原生质体及融合技术的发展历程
• 1.1.2 原生质体融合的技术程序、方法
• 1.1.3 原生质体融合技术在新菌株培育中的应用
• 1.1.4 木霉与绿粘帚霉和球孢白僵菌的原生质体研究现状
• 2 研究的目的及意义
• 3 材料与方法
• 3.1 主要材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 酶
• 3.1.4 农药
• 3.1.5 融合剂
• 3.1.6 仪器
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 F051对球孢白僵菌生长的影响
• 3.2.2 F051原生质体的制备
• 3.2.3 F051原生质体的再生
• 3.2.4 F051原生质体制备和再生条件的探索
• 3.2.5 球孢白僵菌原生质体的制备
• 3.2.6 球孢白僵菌原生质体的再生
• 3.2.7 球孢白僵菌原生质体制备和再生条件的探索
• 3.2.8 遗传标记
• 3.2.9 原生质体融合初探
• 4 结果与分析
• 4.1 F051对球孢白僵菌生长的影响
• 4.2 F051原生质体的制备
• 4.2.1 F051生长曲线的测定
• 4.2.2 F051原生质体释放过程观察
• 4.3 F051原生质体再生过程的观察
• 4.4 F051原生质体制备和再生条件的探索
• 4.4.1 菌龄
• 4.4.2 渗透压稳定剂和稳定剂浓度
• 4.4.3 酶成分
• 4.4.4 酶浓度
• 4.4.5 酶解时间和酶解温度
• 4.4.6 培养基
• 4.4.7 缓冲液系统
• 4.5 球孢白僵菌原生质体的制备
• 4.5.1 球孢白僵菌生长曲线
• 4.5.2 球孢白僵菌原生质体释放过程观察
• 4.6 球孢白僵菌原生质体再生过程观察
• 4.7 球孢白僵菌原生质体制备和再生条件的探索
• 4.7.1 菌龄
• 4.7.2 渗透压稳定剂和稳定剂浓度
• 4.7.3 酶成分
• 4.7.4 酶浓度
• 4.7.5 酶解时间和酶解温度
• 4.7.6 培养基
• 4.7.7 缓冲液系统
• 4.8 遗传标记
• 4.8.1 农药的筛选
• 4.8.2 多菌灵对F051和球孢白僵菌的致死浓度测定
• 4.8.3 标记浓度对F051出发菌株原生质体突变率的影响
• 4.8.4 球孢白僵菌原生质体灭活
• 4.8.5 热灭活处理对球孢白僵菌出发菌株原生质体突变率的影响
• 4.9 原生质体融合初探
• 4.9.1 融合子再生培养基的初筛
• 4.9.2 融合现象的观察
• 5 讨论与结论
• 5.1 F051和球孢白僵菌原生质体制备和再生
• 5.2 融合子筛选模式的确定
• 5.3 绿粘帚霉和球孢白僵菌原生质体融合初探
• 参考文献
• 致谢
• 附图