金鱼生长激素Ⅰ和人角质细胞生长因子异源表达的研究

论文摘要

(1)鱼生长激素（Fish growth hormone,fGH）是鱼类脑垂体中分泌的促进生长的单一亚基的蛋白激素。它参与鱼的生长代谢,能够加速蛋白质合成和脂类降解等生理功能,具有增强食欲、提高饲料转化率的作用。天然鱼GH含量极低,分离纯化成本较高。基因工程技术为生产大量低成本的鱼生长激素创造了条件,且很多实验证明重组鱼GH具有天然鱼GH的功能,却不会对人体产生激素副作用。因此,生产基因重组鱼GH在养殖领域具有重要的应用价值。用引入酶切位点BamHⅠ和NotⅠ的引物,以质粒pBluescript SK-gfGHⅠ为模板,PCR扩增获得了gfGHⅠ编码区序列,分别定向插入原核表达载体pET-28a和pGEX-4T-2中,构建了原核表达载体pET28a-gfGHⅠ和pGEX-4T-2-gfGHⅠ,pET28a-gfGHⅠ转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1.0 mM IPTG诱导下,表达出融合蛋白（His）6 tag-gfGHⅠ,该蛋白分子量大约为26KD;经质谱以及抗HIS抗体的Western blotting鉴定,该融合蛋白即为表达的目的蛋白;经超声鉴定该蛋白为包涵体形式存在,尝试用连续超声破碎的方法,回收该蛋白纯度可达85.1%,免疫小鼠,间接ELISA法检测抗体效价为1:1600。pGEX-4T-2-gfGHⅠ质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经1.0m M IPTG诱导可表达分子量约46 KD的特异蛋白GSTtag-gfGHⅠ。在28-37℃温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白,经28℃诱导的菌体裂解液上清经GST Resin纯化获得GSTtag-gfGHⅠ。纯化的GSTtag-gfGHⅠ腹腔注射锦鲤（Cryprinus carpiod）,经4周处理后,实验组的体重增长率比对照组高24.68%,体长增长率比对照组高11.82%。经t检验统计分析表明,表达的重组gfGHⅠ具有显著的促锦鲤生长作用（P＜0.05）。利用植物作为生物反应器生产具有医用价值的蛋白或者抗体是植物基因工程的一个研究热点。同大肠杆菌等微生物相比,植物作为生物反应器具有翻译后正确的修饰、加工,生产成本低的优点,构建了植物表达载体p1301-35S-gfGHⅠ-Tnos,通过农杆菌介导法转化了水稻愈伤组织。对得到的再生水稻通过组织化学染色、PCR检测,确认外源基因已经成功插入水稻基因组中。进一步通过RT-PCR对转基因株系分析,证明gfGHⅠ基因可以转录。对转基因植株子代进行PCR和RT-PCR检测,发现gfGHⅠ基因能成功的遗传给子代且在子代中同样能够转录成功。（2）角质细胞生长因子（KGF）是成纤维细胞生长因子（FGFs）家族的成员,即FGF-7,最初从人胚胎肺成纤维细胞的培养上清中分离纯化获得。KGF在表皮细胞的生长和更新过程中起着重要作用,能加快膀胱、肾和肠的损伤修复和促人角膜上皮细胞生长。毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白高水平表达、具有近似于哺乳动物细胞翻译后的修饰与加工功能和安全性好等特点。用EcoRⅠ和NotⅠ酶切质粒PMD18-T-KGF,胶回收后定向插入pPIC9K质粒,构建酵母表达质粒pPIC9K-KGF。pPIC9K-KGF质粒用Bpu1102Ⅰ酶切线性处理化后转化毕赤酵母,用G418-MD平板法、菌落PCR和总DNA PCR法筛选重组子,以及MM/MD筛选法鉴定重组菌株表型为His+Mut+,用RT-PCR分析表明,KGF在酵母中成功转录,用SDS-PAGE分析表明,重组KGF蛋白可在毕赤酵母中获得表达,分子量与预期的KGF蛋白大小相近,对蛋白摇瓶表达条件进行优化,诱导4 d后蛋白表达量达到最高。

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ABSTRACT

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第一章金鱼生长激素Ⅰ（gfGH Ⅰ）在大肠杆菌和水稻中的表达

1前言

1.1 鱼生长激素的结构和功能

1.1.1 鱼生长激素的分离

1.1.2 鱼生长激素的结构

1.1.3 鱼生长激素的功能

1.2 鱼类生长激素异源表达研究

1.2.1 大肠杆菌表达体系

1.2.2 蓝藻表达体系

1.2.3 酵母表达系统

1.2.4 植物反应器表达体系

1.3 外源生长激素进入鱼体的途径和方法

1.3.1 GH引入鱼体的途径

1.3.2 GH保护剂的研制

1.4 本实验研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料、菌株、质粒

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株

2.1.3 质粒

2.2 主要化学试剂及仪器

2.2.1 主要化学试剂

2.2.2 主要仪器

2.2.3 质粒抽提相关溶液

2.2.4.SDS-PAGE相关溶液

2.2.5 Western blotting相关溶液

2.2.6 ELISA所用试剂

2.2.7 其它相关溶液

2.2.8 培养基的配制

2.3 引物设计和序列分析

2.4 gfGH Ⅰ基因测序和序列分析

2.5 gfGH Ⅰ基因的原核表达,纯化

2.5.1 原核表达载体pET28a-gfGH Ⅰ和pGEX-4T-2-gfGH Ⅰ的构建

2.5.2 诱导表达及蛋白存在形式

6tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析'>2.5.3 目的蛋白（His）₆tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析

6tag-gfGH Ⅰ的Western blotting检测'>2.5.4 目的蛋白（His）₆tag-gfGH Ⅰ的Western blotting检测

6tag-gfGH Ⅰ'>2.5.5 连续超声破碎法回收目的蛋白（His）₆tag-gfGH Ⅰ

2.5.6 多克隆抗血清的制备

2.5.7 间接ELISA法检测多克隆血清效价

2.5.8 GST Resin纯化介质回收表达的目的蛋白GSTtag-gfGH Ⅰ

2.5.9 Bradford法测定蛋白质含量

2.5.10 GSTtag-gfGH Ⅰ促进锦鲤生长实验

2.6 植物表达载体的构建

2.6.1 中间表达载体的构建和鉴定

2.6.2 gfGH Ⅰ植物表达载体的构建及鉴定

2.7 农杆菌介导的水稻遗传转化

2.7.1 农杆菌感受态的制备与转化

2.7.2 水稻材料（中花11）的预处理

2.7.3 农杆菌侵染液的制备

2.7.4 转化感染

2.7.5 预分化

2.7.6 分化及再生培养

2.8 转基因水稻检测

2.8.1 组织化学染色法检测GUS基因表达

2.8.2 PCR检测转基因植株

2.8.3 RT-PCR检测检测转基因植株

3 结果与分析

3.1 gfGH Ⅰ序列分析

3.2 gfGH Ⅰ的原核表达,纯化,生物活性实验

3.2.1 原核表达载体pET28a-gfGH Ⅰ和pGEX-4T-2-gfGH Ⅰ的构建

3.2.2 诱导表达及蛋白存在形式

6tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析'>3.2.3 目的蛋白（His）₆tag-gfGH Ⅰ的MALDI-TOF-MS分析

6tag-gfGH Ⅰ的Western blotting特异性分析'>3.2.4 目的蛋白（His）₆tag-gfGH Ⅰ的Western blotting特异性分析

6tag-gfGH Ⅰ'>3.2.5 连续超声破碎法回收（His）₆tag-gfGH Ⅰ

3.2.6 间接ELISA检测抗血清效价

3.2.7 GST Resin纯化介质回收GSTtag-gfGH Ⅰ

3.2.8 GSTtag-gfGH Ⅰ的生物活性鉴定

3.3 gfGH Ⅰ植物表达载体构建和鉴定

3.3.1 中间载体pBPF-gfGH Ⅰ构建和鉴定

3.3.2 植物表达载体p1301-35S-gfGH Ⅰ的构建以及鉴定

3.4 水稻愈伤组织的遗传转化

3.5 转基因水稻检测

3.5.1 组织化学染色检测

3.5.2 转基因植株的PCR检测

3.5.3 RT-PCR法检测gfGH Ⅰ基因的转录水平

1代植株的分子生物学检测结果'>3.6 转gfGH Ⅰ水稻T₁代植株的分子生物学检测结果

1代植株获得'>3.6.1 转基因水稻T₁代植株获得

1代株系PCR检测结果'>3.6.2 转基因水稻T₁代株系PCR检测结果

1代株系的RT-PCR检测'>3.6.3 转基因水稻T₁代株系的RT-PCR检测

4 讨论

4.1 gfGH Ⅰ基因的原核表达

4.2 提高原核表达蛋白的可溶性

4.3 多克隆抗血清的制备

4.4 促进锦鲤生长的生物活性实验

4.5 水稻愈伤组织的诱导及转化

4.6 转基因植物的基因沉默

第二章人类角质细胞生长因子（KGF）在毕赤酵母中的表达

1 前言

1.1 角质细胞生长因子概述

1.1.1 角质细胞生长因子及其分子结构

1.1.2 KGF的生物学作用

1.1.3 重组角质细胞生长因子的研究现状

1.2 巴斯德毕氏酵母概述

1.2.1 P.pastoris的生物学与遗传学特性

1.2.2 P.pastoris表达外源蛋白的优势

1.2.3 表达载体

1.2.4 表达宿主菌

1.2.5 外源基因与宿主染色体的整合

1.2.6 外源基因在毕氏酵母中的表达

1.2.7 重组蛋白的翻译后修饰

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.2 主要试剂及溶液的配制

2.2.1 酵母培养基储备液

2.2.2 酵母总DNA的抽提溶液

2.3 融合KGF基因毕氏酵母表达载体的构建

2.4 GS115感受态细胞的制作与转化

2.4.1 GS115感受态的制备

2.4.2 重组表达载体pPIC9K-KGF线性化

2.4.3 表达载体pPIC9K-KGF转化GS115感受态细胞

2.5 转化子的PCR快速鉴定

2.6 重组转化子表型的筛选

2.7 酵母整合的PCR分析

2.7.1 酵母基因组总DNA的提取

2.7.2 PCR扩增

2.8 目的基因在酵母中的表达

2.8.1 酵母的甲醇诱导

2.8.2 RT-PCR检测诱导表达后的转基因酵母

2.8.3 蛋白质的提取

2.8.4 表达蛋白的SDS-PAGE分析

2.9 酵母表达时间的优化

3 结果与分析

3.1 酵母表达载体的构建

3.2 转化GS115阳性克隆的PCR鉴定

3.3 重组转化子表型的筛选

3.4 PCR分析外源基因在酵母中的整合

3.5 RT-PCR检测甲醇诱导的转基因酵母

3.6 外源基因的诱导表达

3.7 外源基因的诱导表达的最佳时间

4 讨论

4.1 毕赤酵母的转化

4.2 转化子的筛选

4.3 基因剂量对外源蛋白的影响

4.4 影响外源蛋白高效表达的外源因素

结论和展望

参考文献

致谢

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