论文摘要
一、研究背景脊髓损伤后（Spinal cord injury,SCI）轴突难以有效再生是脊髓损伤研究的难点之一,这与脊髓损伤后周围环境中存在不利于轴突生长的抑制因子有关。近年来,髓鞘相关抑制分子如Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白（Myelin-associated glycoprotein,MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（Oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp）及Nogo-66受体（Nogo-66 receptors,NgRs）介导的信号转导途径的相继发现深化了人们对SCI轴突再生分子机制的认识,同时也找到了SCI治疗研究新的切入点,以Nogo或NgRs为靶点的治疗成为脊髓损伤研究新的热点。然而,迄今为止,相关实验研究仍未取得突破性进展:单克隆抗体IN-1可以拮抗Nogo的抑制作用,但无法与另外两种抑制物MAG和OMgp结合;NgRs的竞争性短肽NEPI-40可对抗Nogo-66诱导的轴突生长抑制作用,但对除Nogo-66外的其他髓鞘抑制物不敏感。因此,找到另一种更有效清除髓鞘抑制因子的办法成为当务之急。巨噬细胞是人体内的炎性细胞,在创伤修复过程中起着重要作用。目前,对巨噬细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用,人们的认识并不一致:一种认为巨噬细胞对轴突生长有抑制作用;另一种则认为巨噬细胞对轴突的再生起到促进作用。既往观点认为,中枢神经系统的无菌性炎症反应是有害的,尤其对于SCI后的反应。然而,在整个机体组织的修复过程中,炎性反应贯穿始终,而炎性细胞中,巨噬细胞发挥了主要作用,它能清除坏死组织并分泌营养因子,在所有机体组织修复中起着重要作用。近期研究显示,巨噬细胞在髓鞘碎片吞噬、促进轴突再生及再髓鞘化过程中发挥的作用可能超出我们的预期。1998年,Zeev-Brann报道成熟哺乳动物中枢神经系统损伤后的自我修复过程中发现了骨髓衍生炎性细胞;随后,2003年,Buss等发现巨噬细胞在局部的延迟浸润与脊髓挫伤后髓鞘碎片的持续存在密切相关,并且可导致轴突再髓鞘化过程受抑制。2007年,Samuel David等则进一步证实,巨噬细胞是否表达NgRs及其浸润与撤离过程关系到轴突再髓鞘化过程能否顺利进行,并进而影响脊髓神经细胞的生理机能恢复。二、研究目的分离、培养、鉴定大鼠脊髓损伤局部巨噬细胞,并对其形态、生长特点等生物学特性进行研究,观察其是否表达NgRs;研究原代神经干细胞（neural stem cells,NSCs）及嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells, OECs）等的体外分离方法、细胞培养体系,探讨巨噬细胞、神经干细胞及嗅鞘细胞的移植应用可行性;将表达NgRs的巨噬细胞与神经干细胞联合移植到脊髓全横断损伤大鼠模型体内,并与嗅鞘细胞、神经干细胞等不同移植组比较,观察其对移植神经干细胞存活、分化、突触形成及大鼠脊髓神经功能恢复情况的影响,探讨表达NgRs的巨噬细胞在脊髓损伤修复中的可能作用机制,为进一步动物研究及临床应用提供实验和理论依据。三、内容和方法（一）用酶消化法分离获取大鼠脊髓损伤局部原代巨噬细胞,对其进行生物学鉴定,观察其细胞形态、生长特点,使用免疫荧光化学染色观察其NgRs表达情况;（二）分离新生大鼠嗅球,解剖显微镜下选取嗅球最外二层进行酶解后培养,利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制剂法对嗅鞘细胞进行纯化,用免疫细胞化学方法鉴定不同时期嗅鞘细胞的纯度;（三）无菌条件下分离鼠胚脑组织,使用含DNA酶的胰蛋白酶消化后制作神经干细胞单细胞悬液,DMEM/F12培养基悬浮培养,观察其细胞学特点与生长曲线,添加诱导剂后观察其分化情况;（四）选取细胞活力旺盛的原代巨噬细胞、嗅鞘细胞及神经干细胞,调整细胞浓度,hoechst33342标记神经干细胞;将脊髓全横断模型大鼠分为4组,分别移植巨噬细胞和NSCs悬液、OECs和NSCs悬液、NSCs悬液、DMEM/F12培养液;观察术后各组神经干细胞存活、分化、突触形成及大鼠BBB运动功能评分等各项指标。四、研究结果（一）原代培养的巨噬细胞1小时后迅速贴壁生长,细胞形态呈圆形、椭圆形等,体积大,胞浆丰富,培养1～2周内细胞活动旺盛,免疫荧光化学染色显示CD68抗原阳性,多数细胞NgRs抗原阳性;（二）原代培养5d的OECs胞体呈长梭形,多极状,立体感强,折光性好。8d后,胞体变大,突起变长,并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态,贴壁第2、7d的细胞染色,P75阳性达到95%以上,随后阳性率逐步下降,第14d细胞染色阳性率降至90%。25d则仅为50%;（三）原代培养的神经干细胞呈球团状悬浮生长,球体折光性好,边缘毛躁,细胞排列整齐,高倍镜下可见神经球周边毛刺状的细小突起,细胞生长速度较快。免疫细胞化学染色提示Nestin抗原阳性,添加血清诱导后,可分化成NF-200及GFAP抗原阳性细胞。（四）表达NgRs的巨噬细胞与神经干细胞联合移植4W后,SCI大鼠BBB运动功能评分明显高于对照组、NSCs组及OECs、NSCs联合移植组,具有统计学差异（P<0.05）,且随着时间延长差异更显著;同时,荧光显微镜下观察到该组hoechst33342标记神经干细胞荧光强度及密度也较其余三组高,该组免疫组织化学染色可观察到更多的NF-200阳性细胞及Synaptophysin抗体染色阳性细胞。五、实验结论成功地从脊髓损伤局部分离出表达NgRs抗原的巨噬细胞,对其细胞学特性及生物学特性获得一定了解,获得足够数量的NSCs及OECs,为实验研究提供了理想的移植材料;表达NgRs的巨噬细胞能改善脊髓轴突再生微环境,提高移植神经干细胞的生存率和神经元分化率,有利于神经细胞突起间突触的形成,进而促进损伤脊髓的神经功能恢复。其机制可能是巨噬细胞通过表达的NgRs介导胞内信号途径调节对髓鞘等坏死组织的吞噬作用,从而为神经再生创造条件。这为脊髓损伤的治疗研究提供了一个新的解决途径,也为进一步动物研究和临床应用奠定了可靠的实验基础和理论依据。