鳜胃蛋白酶原早期发育表达及两种胃泌素家族基因的克隆与表达

论文摘要

胃蛋白酶原（Pepsinogen, PG）是胃蛋白酶的前体，在胃酸作用下能够激活成为活性形式的胃蛋白酶。本实验室前期获得了鳜（Sinipercachuatsi）三种胃蛋白酶原PG A1、PG A2和PG C cDNA全长序列，为进一步了解鳜胃蛋白酶原早期发育表达特征，论文采用荧光定量PCR技术检测了鳜孵化后0-22天（days post hatching, dph）胃蛋白酶原mRNA表达水平变化，结果表明，3种胃蛋白酶原mRNA表达均始于8dph，之后表达量都呈上升趋势，PG A1表达量最高，其次是PG A2，PG C表达量最低。它们的表达各具特点，其中，PG A2在16-22dph表达量比较平稳。三种胃蛋白酶原mRNA的表达时间都早于胃腺的出现时间（13-14dph），推测13dph以前观察到的胃蛋白酶原mRNA表达可能并不是由胃腺表达的，而是由其它组织表达的。胃蛋白酶作为胃蛋白酶原的活性形式，是消化道中的重要消化酶，是胃内酸性消化的执行者，对食物蛋白质的初步消化起重要作用，胃蛋白酶活性的大小反映了胃的消化能力。在鳜早期发育阶段，胃组织尚未分化发育，此时仔鱼消化主要是依靠胞饮作用进行胞内消化，以及碱性消化作用。随着消化系统的发育，出现了胃和胃腺，胃腺分泌胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在胃酸作用下形成活性形式的胃蛋白酶，仔鱼消化方式由碱性消化转变为消化道内更有效的酸性消化。本研究检测了鳜孵化后0-22天胃蛋白酶样活性大小变化，结果显示酶样活性呈现较大的波动，在早期（0-8dph）就有检测到较低水平的活性，而此时胃腺尚未出现，胃蛋白酶原基因也未表达，这一时期的胃蛋白酶样活性可能是由母源性的胃蛋白酶或其它天冬氨酸蛋白酶所致。8dph后胃蛋白酶样活性迅速上升，这与胃蛋白酶原mRNA水平的表达特征一致。胃蛋白酶分泌受多种胃肠激素影响，胃泌素（gastrin, GAS）与胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）对胃蛋白酶原分泌都有一定的调控作用，GAS主要刺激胃酸分泌，CCK主要促进胆囊排空及胰液分泌，鱼类中尚缺乏GAS、CCK的功能系统研究。论文采用RACE技术克隆了鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA序列，GAS基因cDNA全长581bp，5’非翻译区100bp，3’非翻译区145bp，开放阅读框336bp，编码111个氨基酸；CCK具有2种类型：CCK1与CCK2，CCK1cDNA全长为843bp，5’非翻译区60bp，3’非翻译区369bp，开放阅读框414bp，编码137个氨基酸；CCK2cDNA全长846bp，5’非翻译区112bp，3’非翻译区332bp，开放阅读框403bp，编码134个氨基酸。GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构（DYQGWVDF/DYLGWMDF），仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明，GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂，CCK1与CCK2mRNA在脑中表达量最高，在肠和幽门垂也有较高表达，表明GAS与CCK同为消化调控因子，而CCK还是重要神经分泌因子。GAS与CCK mRNA表达贯穿于鳜整个幼体早期发育阶段（孵化后0-22天），前期表达水平较高，后期表达水平较低，并趋于平稳，GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 鱼类胃蛋白酶原研究进展
• 1.1 鱼类胃蛋白酶原的种类
• 1.2 鱼类胃蛋白酶原的结构特征
• 1.3 鱼类胃蛋白酶原基因表达研究
• 1.4 鱼类早期发育阶段胃蛋白酶活性的研究
• 1.5 胃蛋白酶原的分泌与调控
• 2 鱼类胆囊收缩素、胃泌素的研究进展
• 2.1 鱼类胆囊收缩素的研究进展
• 2.2 鱼类胃泌素的研究进展
• 3 本研究所要解决的问题
• 4 研究目的与意义
• 第一章 鳜胃蛋白酶原基因与胃蛋白酶活性早期发育表达
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 材料与试剂
• 1.2.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 鳜早期发育阶段个体总 RNA 提取
• 1.3.2 qPCR 各引物标准曲线及溶解曲线
• 1.3.3 鳜发育早期胃蛋白酶原 mRNA 表达特征
• 1.3.4 鳜发育早期总胃蛋白酶活性特征
• 1.4 讨论
• 1.4.1 鳜胃蛋白酶原基因表达
• 1.4.2 鳜胃蛋白酶样活性分析
• 第二章 鳜胃泌素家族基因克隆及表达研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料与实验试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 组织总 RNA 提取及幼体总 RNA 提取检测
• 2.3.2 鳜 GAS 与 CCK cDNA 序列分析
• 2.3.3 鳜 GAS 与 CCK qPCR 引物验证
• 2.3.4 鳜 GAS 与 CCK mRNA 的组织表达
• 2.3.5 鳜 GAS 与 CCK mRNA 的早期发育表达
• 2.4 讨论
• 2.4.1 鳜 CCK/GAS 序列与结构分析
• 2.4.2 鳜 GAS/CCK 组织表达及与胃液分泌的关系
• 2.4.3 鳜早期发育 GAS/CCK 表达特点
• 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表论文
• 致谢