东北林蛙抗菌肽cDNA克隆及在毕赤酵母中融合表达的研究

论文摘要

两栖动物皮肤抗菌肽是由皮肤粒状腺体分泌的,由10～50个氨基酸残基组成的小分子多肽,通常带正电荷,具有广谱抗菌活性及其它生物学功能,构成两栖类动物先天免疫的第一道防线。其抗菌谱广、不易产生耐药性等特点引起人们极大的兴趣,有望成为新一代临床抗菌药物。国外对蛙类抗菌肽的研究已有数年历史,目前已有肽类抗生素进入临床试验阶段。东北林蛙作为主要分布在我国东北地区的两栖动物,其皮肤抗菌肽分子水平的研究尚处于起步阶段,仅有零星序列的报道。因此,开展针对东北林蛙抗菌肽的基因结构、生理生化性质、功能方面及工程菌的构建等方面的研究对其应用开发有着重要理论及实践意义。本研究根据多种蛙类抗菌肽基因5’端保守序列设计了简并引物,利用其对林蛙皮总RNA反转录得到的cDNA进行扩增。得到全长的东北林蛙抗菌肽基因文库并对文库进行随机序列测定。测序结果采用CLUSTALW软件进行多序列对比,通过EXPASY生物软件对抗菌肽氨基酸序列进行理化性质分析及结构预测,得到11种东北林蛙抗菌肽基因。其中dybowskin-5、dybowskin-6、dybowskin-7、dybowskin-8和dybowskin-9属于Temporin家族;dybowskin-1、dybowskin-2、dybowskin-3属于Brevinin-1家族。dybowskin-4与日本林蛙抗菌肽Japonicin-1序列较为一致,14个氨基酸残基中仅相差一个。dybowskin-10和dybowskin-11与以往发现的其它蛙类抗菌肽序列有很小的相似性,应属于新报道的家族序列,分别命名为:Dybowskin-2CDYa、Dybowskin-2CDYb。其理化性质与其它抗菌肽性质有明显差别:带有较多正电荷;C末端不进行酰胺化修饰;等电点较高,为强碱性多肽;亲水性强。将人表皮生长因子基因3’端与Dybowskin-2CDYa基因成熟肽序列5’端通过凝血酶切割位点（LVPRGS）相连,并连接到真核分泌表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒。经过DNA测序分析,质粒序列与设计吻合,读码框无误。将该质粒转化入毕赤酵母GS115,构建真核表达系统,对融合多肽进行甲醇诱导表达。利用三氯乙酸对发酵液上清进行沉淀,沉淀进行15 % Tricine-SDS-PAGE分析,电泳结果显示在蛋白标准品9 kDa位置处有目的条带出现。提取经甲醇诱导后的宿主细胞总RNA,利用α-factor引物、3’AOX引物对反转录后得到的cDNA进行扩增,电泳结果显示450 bp位置处有特异片段产生,说明目的基因已插入宿主染色体中并已转录。对发酵上清液进行RP-HPLC分析,色谱图中目的多肽保留时间为21.78 min,峰面积为6.32 %。同时对发酵上清液进行蛋白含量测定,结果为4.79μg/μL。经计算,融合多肽的表达量约为0.30 g/L。利用反向色谱柱（10×150 mm,5μm,ODS）对发酵上清液进行分离纯化。对纯化后多肽及发酵上清液进行抗菌试验,结果显示二者均对蜡状芽孢杆菌标准株（CGMCC1.126）、出血性大肠杆菌O157、鲍曼溶血不动杆菌、产气肠杆菌、耳葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门杆菌等多种受试菌株均有抑菌活性,但抑菌活性不同。纯化后的融合多肽溶液对O157、产气肠杆菌的抑菌效果优于发酵上清液;对耳葡萄球菌的抑菌效果显示,发酵上清液的抑菌效果明显优于纯化后融合多肽溶液;对其它菌种的抑菌效果则没有明显差别。本文研究结论:筛选得到的11种东北林蛙抗菌肽基因中Dybowskin-2CDYa、Dybowskin-2CDYb为未报道的新家族序列;成功构建hEGF-Dybowskin-2CDYa融合多肽的真核表达系统—pPIC9k/hX2;其对宿主细胞GS115转化,对筛选得到的8号重组子进行甲醇诱导表达,经RP-HPLC分析,融合多肽的表达量为0.30 g/L,经Tricine-SDS-PAGE分析,表达产物分子量为9 kDa;通过对融合多肽进行抗菌活性分析,证实融合多肽对蜡状芽孢杆菌（CGMCC1.126）、出血性大肠杆菌O157、鲍曼溶血不动杆菌、产气肠杆菌、耳葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门杆菌等多种菌株具有广谱的抗菌活性。本文研究结果为东北林蛙抗菌肽的开发应用奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 概述
• 1.2 蛙科动物抗菌肽分类
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展
• 1.4 本文目的与意义
• 第2章 东北林蛙皮肤抗菌肽基因的克隆和序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 菌种和载体
• 2.2.3 工具酶与生化试剂
• 2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.5 溶液与培养基的配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 东北林蛙抗菌肽通用引物的设计
• 2.3.2 东北林蛙皮肤总RNA的提取
• 2.3.3 东北林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆
• 2.4 结果
• 2.4.1 引物设计结果
• 2.4.2 东北林蛙皮总RNA的提取结果
• 2.4.3 东北林蛙皮抗菌肽的cDNA扩增结果
• 2.4.4 重组质粒的PCR检测验证
• 2.4.5 测序结果及其序列分析
• 2.4.6 东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的同源性分析结果
• 2.4.7 东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的结构分析
• 2.5 讨论
• 第3章 hEGF-抗菌肽融合多肽真核表达载体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌种和载体
• 3.2.2 工具酶与生化试剂
• 3.2.3 主要仪器和设备
• 3.2.4 溶液与培养基的配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 实验思路
• 3.3.2 引物设计
• 3.3.3 PCR方法扩增hEGF基因
• 3.3.4 PCR方法扩增Dybowskin-2CDYa成熟肽序列
• 3.3.5 PCR方法扩增融合多肽序列
• 3.3.6 融合多肽表达质粒的构建及序列分析
• 3.4 结果
• 3.4.1 融合多肽 hX2 基因序列的获得
• 3.4.2 阳性重组质粒的PCR筛选结果
• 3.4.3 阳性重组子测序结果
• 3.5 讨论
• 第4章 重组基因hX2 毕赤酵母中的表达及检测
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 工具酶与生化试剂
• 4.2.3 主要仪器和设备
• 4.2.4 溶液与培养基的配制
• 4.3 方法
• 4.3.1 转化酵母菌的线性质粒制备
• 4.3.2 酵母感受态细胞的制备
• 4.3.3 线性化质粒转化毕赤酵母GS115
• 4.3.4 高拷贝转化子的筛选
• 4.3.5 高拷贝转化子的表型鉴定
• 4.3.6 酵母转化子的鉴定
• 4.3.7 高拷贝阳性转化子的摇瓶诱导表达
• 4.3.8 目的基因表达的检测
• 4.3.9 发酵液中蛋白含量测定
• 4.3.10 重组表达蛋白的抑菌活性检测
• 4.4 结果
• 4.4.1 高拷贝转化子的表型鉴定
• 4.4.2 酵母DNA 的提取结果
• 4.4.3 酵母转化子的PCR 鉴定结果
• 4.4.4 阳性转化子 RNA 提取
• 4.4.5 对酵母mRNA 反转录PCR 结果
• 4.4.6 融合多肽Tricine-SDS-PAGE 分析结果
• 4.4.7 发酵上清液液相色谱检测结果
• 4.4.8 发酵上清液中蛋白含量的测定
• 4.4.9 表达产物抑菌活性检测
• 4.5 讨论
• 4.5.1 培养水平对表达的影响
• 4.5.2 融合多肽的抗菌活性
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况