丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究

论文题目: 丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 陈丽珊

导师: 任大明

关键词: 多表位抗原,丙型肝炎病毒,疫苗,免疫应答,感染,保护反应

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒，其基因组编码约3010～3033aa的蛋白前体，从N-端起依次为核心蛋白（C）、包膜蛋白（E）、非结构蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的变异性，能够迅速突变逃逸宿主的免疫系统。因此，给疫苗的研究带来许多的困难。近年来的研究提示理想的HCV疫苗必须能够诱发高水平、广谱而特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。针对HCV的高度变异性及免疫特点，在HCV基因产物中优选了5个具有良好免疫原性的高度保守B／T细胞表位，组合成一个多表位抗原基因pcx，这些表位分别来自核心蛋白（1～16aa，132～141aa），E1（126～135aa），NS3（139～147aa）及NS5B（768～775aa），以及破伤风毒素的T细胞表位用以增强T细胞免疫。前期的研究表明与β-半乳糖苷酶融合表达的多表位抗原PCX具有良好的HCV免疫特异性。 pcx基因经过串联重复之后，构建成多表位抗原基因pcx3，与6×His-tag融合后，在E.coli宿主中获得高效表达。利用C端融合的6×His-tag经过Ni2+-NTA-agarose亲和层析柱纯化后，得到高纯度的目的蛋白。利用BCA法对蛋白质进行定量。 Western blot结果显示原核或真核表达的PCX3抗原均能被HCV患者阳性血清所识别，表明多表位抗原具有能被HCV抗体特异性识别的表位。ELISA结果显示来自不同地区的不同患者血清中抗-HCV抗体能与PCX3抗原特异反应，62份阳性血清中PCX3抗原检测的检出率为83.8％，提示PCX3抗原的B细胞表位能被HCV抗体广泛识别。而PCX抗原的检出率为70％，表明经过串联重复后的抗原与HCV抗体的反应更强，显示出良好的免疫原性。纯化的PCX3蛋白与完全弗氏佐剂一起免疫BALB／c小鼠后，能够诱发高滴度的特异性IgG（1×106），并持续保持数月。不同剂量组进行比较，发现50μg的剂量能够诱发理想的体液免疫反应。另外，利用PCX免疫小鼠的特异性抗体滴度最高达1×104，这一结果表明，与PCX抗原相比，串联重复的PCX3抗原能够诱发更强的免疫反应。抗PCX3抗血清与多肽的反应显示位于核心蛋白的P1（MTSTNPKPQRKTKRNTN）以及NS3蛋白的P6（TGDFDSVID）这两个B细胞表位与抗体反应的滴度较高，提示二者在诱导HCV特异的体液免疫反应中发挥主要作用。 PCX3蛋白可诱发较高水平的特异性CTL效应，特异性杀伤率为39.2％。在多肽表位中，NS5B的T细胞表位（ELITSCSS）的溶解率最高，提示该表位在诱发CTL杀伤效应中具有重要的作用。流式细胞仪检测外周血淋巴细胞表明，HCV多表位抗原PCX3免疫小鼠6周后，CD3+CD4+T细胞比例明显升高，说明该蛋白可以有效刺激CD3+CD4+Th细胞增殖。针对免疫小鼠的安全性评价表明这一多表位抗原免疫是安全而有效的。利用实时荧光定量PCR技术检测PCX3抗血清体外与病毒粒子（genotype 2a）的结合，实验结果表明孵育过夜后，PCX3抗血清在体外能够结合绝大部分的病毒粒子，初步显示PCX3抗血清具有抗病毒感染的可能，为进一步抑制病毒感染的试验提供基础。本实验中用于检验体液免疫被动保护反应的模型是SCID／Alb-uPA转基因小鼠。这种SCID／Alb-uPA纯合的小鼠体内进行人体肝细胞移植后，建立具有嵌合的人肝组织的转基因小鼠。利用HCV阳性血清进行腹膜内注射感染，病毒不仅能够复制，而且产生了具有感染性的颗粒，可以作为HCV感染的小鼠模型。利用该模型的研究表明HCV阳性血清（HCV genotype la，3.0E+6 IU／ml）与PCX3诱导的高滴度抗血清孵育过夜后进行感染，两周后检测发现实验组中有两只小鼠血清中含有低于500U的RNA拷贝数，其它三只血清中的RNA则为阴性，而对照组的7只小鼠全部感染了HCV，血清中的RNA拷贝数为3.0E+03到3.5E+06 IU／ml。这一结果表明PCX3诱导的抗血清能使2／5的小鼠病毒滴度显著减少，并且保护3／5的小鼠避免HCV感染，在被动免疫保护反应方面发挥重要的作用。对PCX3抗血清进行分析，发现它能与HCV的核心蛋白、NS3蛋白特异性结合，验证了抗血清中含有抗核心蛋白与NS3蛋白的抗体。利用PCX3抗原制备的单克隆抗体中筛选到两株分别与HCV核心蛋白以及NS3蛋白结合，一株与包膜蛋白E1的表位多肽P5（RMAWDMMMW）反应的单抗。表明PCX3诱导的体液免疫反应中包含这三个蛋白的B细胞表位（P1，P5和P6）所引起的免疫反应，且这些单抗可用于进一步研究抗体与病毒粒子的结合。在此基础上，选取抗核心蛋白的杂交瘤细胞株进行抗体的基因克隆，以期获得具有应用价值的单链抗体，结果筛选到表达特定条带的阳性克隆株，并经过测序鉴定。为抗体的应用研究奠定基础。综上所述，我们的结果表明，本研究所构建的多表位抗原PCX3可以诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答，产生的抗体不仅能在体外结合基因型2a的HCV病毒粒子，且更重要的是，在小鼠的感染模型中抑制了基因型1a的HCV感染，因此，这一抗原有望成为广泛而有效的HCV疫苗候选者。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分前言

一、丙型肝炎病毒的基因组结构及功能

(一)HCV蛋白的翻译、加工及其功能

(二)HCV复制

(三)病毒颗粒的生活周期

二、HCv逃避宿主细胞内的防御机制

(一)、宿主抗感染的反应

(二)、控制和逃避宿主反应

1.利用病毒蛋白控制和逃避宿主反应

2.病毒突变与宿主反应

三、HCV的治疗

(一)、干扰素基础上的治疗

(二)、以分子为基础的治疗策略

1.HCV蛋白酶抑制剂

2.反义核昔酸

3.RNA干扰技术

4.核酶

5.分子治疗载体

四、丙型肝炎疫苗

五、HCV动物模型

(一)、黑猩猩

(二)、转基因小鼠

(三)、携带人肝组织的转基因小鼠

六、展望

参考文献:

第二部分 HCV多表位抗原基因pcx3的构建、表达和纯化

一、材料

二、试剂

三、方法

1 抽提质粒

2 pxc3基因的克隆以及重组表达载体的构建

3 目的基因的原核表达

4 目的基因的真核表达

5 目的蛋白的纯化及定量

6 蛋白质的复性

7 利用BCA法进行蛋白质定量:根据BCA蛋白质定量检测试剂(SK3021)操作方法:

8 EILSA检测多表位抗原与患者抗-HCV血清反应的特异性

9 Western blot检测多表位蛋白与抗-HCV抗体反应的特异性

四、结果

1 多表位抗原基因pcx3的表位组成及克隆

2 多表位抗原基因cPx3和pxc的表达与纯化

3 蛋白质浓度的测定

4 PCX3蛋白抗-HCV抗体反应的特异性

五、讨论

第三部分 HCV多表位基因工程抗原PCX3在小鼠体内免疫应答的研究

一、材料

1 试剂

2 多肤

3 动物

二、方法

1 免疫

2 特异性抗体的检测

3 细胞免疫的检测

4 安全性评价

5 统计学处理

三、结果

1 多表位抗原诱导的特异性体液免疫应答

2 CTL反应

3 淋巴细胞亚群分析

4 安全性评价

四、讨论

第四部分 HCV多表位抗原PCX3抗血清体外中和病毒的研究以及单克隆抗体的制备

一、材料

二、试剂

三、方法

1.Western blot

2.抗血清体外结合病毒试验

3.抗血清抑制转基因小鼠体内HCV感染的实验

4.单克隆抗体的制备

四、结果

1.PCX3诱导的抗血清体外结合病毒粒子

2.PCX3诱导的抗血清能够在转基因小鼠模型中抑制HCV的感染

3.抗血清与HCV蛋白的特异性结合

4.抗HCV核心蛋白、包膜蛋白、NS3蛋白单克隆抗体的制备

五、讨论

第五部分丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体基因的克隆及表达

一、材料

1 细胞株、菌株与质粒

2 试剂

3 仪器

二、方法

(一)单克隆抗体可变区基因的克隆

1 小鼠杂交瘤细胞中抽提总RNA

2 mRNA逆转录成cDNA

3 扩增轻链、重链可变区cDNA

4 PCR片段的纯化

5 连接pMD18-T载体

6 转化大肠杆菌DH5α

7 转化子的筛选及测序

(二)scFv的构建

1 设计引物并利用PCR连接重链与轻链可变区

2 PCR片段与pMD18-T载体的连接、转化及鉴定

3 连接pET19b+表达载体

4 选取阳性克隆进行小量表达

三、结果

1 重链与轻链可变区的基因克隆

2 重链与轻链可变区序列的测序

3 单链抗体基因的构建和表达

4 预测单链抗体的立体模型

四、讨论

小结

参考文献

缩写词中英文对照表

致谢

博士生期间获奖与发表论文目录

发布时间: 2007-06-28

丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究

猜你喜欢