鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株毒力变异的研究

论文摘要

本研究是按OIE及欧盟标准鉴定中国分离的鸡传染性法氏囊病超强毒（vvIBDV）Gx株,通过致弱和分子分析研究来揭示vvIBDV毒力变异的分子基础。 本研究成功地将vvIBDV Gx株通过SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞传代致弱,揭示了vvIBDV Gx株由超强毒向弱毒转化过程中,主要结构蛋白VP3基因和非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变异规律。对经细胞传代的不同代次病毒进行了基因序列分析,发现病毒经细胞传代至第7代（CEF-7）之前,VP3基因序列没有改变,在CEF-8的VP3基因只有一些核苷酸的改变,没有氨基酸的替代,氨基酸序列与参考株vvIBDV HK46的同源性为99.6%。而CEF-9的VP3基因核苷酸序列发生了很多变化,并且出现一些氨基酸的替代。在CEF-10到CEF-20之间的各代次的VP3基因的序列没有发生改变,已基本保持稳定,与参考的弱毒株P2的氨基酸序列同源性达100%;CEF-10的VP3基因在28H,163E,226P,235V和250A分别变为Q,D,L,A和T,发生变异的代次是CEF-9,并且28H也是Gx毒株所特有的。在CEF-7之前,VP5基因序列未发生改变,在CEF-8的VP5基因只有几个核苷酸的改变,没有氨基酸的替代,氨基酸序列与HK46的同源性为98.7%。而CEF-9的VP5基因核苷酸序列发生了很多变化,并且出现一些氨基酸的替代。在CEF-10到CEF-20之间的各代次的VP5基因的序列没有发生改变,已基本保持稳定,与P2的氨基酸序列同源性达99.3%,CEF-10的VP5基因在18E,49R,78F,91E,104G,122Y,129P和137W分别变为K,G,I,G,C,H,S和R,发生变异的代次也是CEF-9,并且104G和122Y也是本毒株所特有的。从而我们得出结论,病毒在传代致弱过程中,强弱毒之间的转变发生在CEF-8至CEF-10之间,通过这一中间代次的过渡,VP2,VP3和VP5最终由具备vvIBDV分子特征转变成为具备与其他弱毒株相似的分子特征,毒力变异的总趋势是毒力逐渐变弱的,最终变成弱毒株,所形成的弱毒分子特征自CEF-10代次后保持稳定。VP3的1个氨基酸和VP5的2个氨基酸是Gx株所特有的,这为各个强弱毒株间的鉴定提供了很好的依据。 致病性试验表明,原代毒对4周龄SPF鸡致死率达64%;CEF-5、CEF-8致死率达60%,仍为超强毒;从CEF-9代病毒的致病性开始降低,致死率为28%,而CEF-10、CEF-15和CEF-20是无致病性的,这也表明CEF-9是病毒发生转变的过渡代次。返强试验表明,CEF-20在鸡体内传6代不返强,表明该弱毒株表现出很好的稳定性。VN实验表明,病毒在CEF细胞传代的过程中,其抗原性没有发生显著的改变。 进一步对CEF-9的分子生物学及生物学特性进行了研究,结果表明其VP3和VP5基因序列既具有超强毒的特征,又兼有部分致弱毒的特征,其致病性介于超强毒株和致弱株之间;在体内外均不稳定,体外继续传代可进一步致弱,回归体内毒力可迅速返强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鸡传染性法氏囊病研究概况
• 1.1.1 病原学
• 1.2 鸡传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展
• 1.2.1 病毒基因组结构及功能
• 1.2.2 病毒抗原性变异的分子基础
• 1.2.3 病毒毒力变异的分子基础
• 1.2.4 病毒与细胞凋亡
• 1.2.5 新型疫苗的研究进展
• 1.3 结束语
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 SPF鸡与SPF鸡胚
• 2.1.3 菌种和载体
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 引物的设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒致弱的过程
• 2.2.2 病毒的电镜观察
• 2.2.3 IBDV病毒基因组RNA的提取
• 2.2.4 各代次病毒基因的反转录反应及其扩增
• 2.2.5 PCR产物的纯化与克隆
• 2.2.6 重组质粒的筛选及鉴定
• 2.2.7 病毒基因核苷酸序列的测定
• 2.2.8 序列分析比较
• 50的测定'>2.2.9 各代次毒株EID₅₀的测定
• 2.2.10 致病性试验
• 2.2.11 中间株的生物学特性
• 2.2.12 致弱株的生物学特性
• 3 结果
• 3.1 电镜观察结果
• 3.2 RNA的提取
• 3.3 反转录及基因扩增
• 3、VP₅基因'>3.3.1 各代次病毒VP₃、VP₅基因
• 3.3.2 A片段基因
• 3.4 重组质粒的筛选和鉴定
• 3重组质粒'>3.4.1 T载体-VP₃重组质粒
• 5重组质粒'>3.4.2 T载体-VP₅重组质粒
• 3.5 vvIBDV-Gx A片段全长
• 3、VP₅基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析'>3.6 各代次VP₃、VP₅基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析
• 3基因'>3.6.1 VP₃基因
• 5基因'>3.6.2 VP₅基因
• 50'>3.7 各代次毒株EID₅₀
• 3.8 致病性试验
• 3.9 中间株的生物学特性
• 3.9.1 体外生长试验
• 3.9.2 体内稳定性试验
• 3.10 致弱株的生物学特性
• 3.10.1 生长特性试验
• 3.10.2 病毒的返强试验
• 4 讨论
• 4.1 研究过程与结果
• 4.2 病毒的细胞培养及致弱
• 4.3 过渡代次毒株CEF-9
• 4.4 vvIBDV毒力基因定位
• 4.5 研究意义
• 5 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢