多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体的制备及初步应用

论文摘要

产毒素多杀性巴氏杆菌（toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm）是猪进行性萎缩性鼻炎（Swine progressive atrophic rhinitis,PAR）的主要病原菌。该菌分泌产生的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）是一种约146kDa的皮肤坏死毒素。该毒素由toxA基因编码,是产毒素多杀性巴氏杆菌的主要致病因子之一。PMT有很强的致病性,只注射少量提纯的PMT就可以复制出典型的PAR症状。鉴于PMT在PAR的产生过程中所起的重要作用,有关PMT及其抗体的检测便成为诊断PAR的关键。检测产毒素多杀性巴氏杆菌毒素抗体可为疫苗免疫效果的评价、PMT抗体的监测提供一种重要方法,并为猪进行性萎缩性鼻炎的诊断提供依据。本研究利用大肠杆菌表达蛋白制备抗PMT的单克隆抗体,旨在建立检测PMT抗体的单抗竞争ELISA方法用于猪进行性萎缩性鼻炎的临床检测,为该病的净化提供有用的检测手段。具体研究情况如下:1.多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体的制备以两个纯化的多杀性巴氏杆菌毒素基因片段的原核表达蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法和Western-blot筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得11株能稳定分泌抗PMT毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株。其中识别PMT-C蛋白的6株,分别命名为CG8、AH12、BA12、AH10、DC1和CH4;识别PMT-N的单抗5株,分别命名为1A7、2C7、3D2、285和4D1。11株单克隆抗体的腹水效价都在100×29以上,相对亲和力都在104以上。Western-blot和ELISA表明所有单抗特异性良好。2.竞争ELISA的建立和初步应用单抗经辛酸-硫酸铵法纯化后,按照改良过碘酸钠法进行了标记。以原核表达蛋白PMT-C为抗原,以辣根过氧化物酶标记的单抗AH12为检测抗体,建立了检测PMT抗体的单抗竞争ELISA方法,用方阵滴定确定蛋白包被浓度为223ng/ml,酶标单抗的工作浓度为1:3200,通过检测160份阴性血清,20份阳性血清,初步确定血清抑制率大于40%判定为阳性。使用竞争ELISA法和细胞毒性中和试验同时检测已知的50份血清,结果显示两者的阳性符合率为90%,阴性符合率为100%;使用竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时检测未知的82份血清,结果显示两者总的符合率为91.5%。应用该ELISA方法对湖北省某些大型猪场的血清样品进行了初步调查,共检测血清1054份,其阳性检出率为26.7%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 1 文献综述
• 1.1 猪萎缩性鼻炎及其危害
• 1.2 猪萎缩性鼻炎的病原学
• 1.3 多杀性巴氏杆菌毒素的生物学特性
• 1.4 猪进行性萎缩性鼻炎诊断技术研究进展
• 1.4.1 病原学诊断
• 1.4.2 血清学检测
• 1.4.3 X射线检查
• 1.5 猪萎缩性鼻炎的防制
• 1.5.1 环境净化
• 1.5.2 疫苗预防
• 1.5.3 药物治疗
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种、质粒及细胞
• 3.1.2 试验动物
• 3.1.3 血清
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组蛋白的表达
• 3.2.2 表达蛋白的鉴定
• 3.2.3 重组可溶蛋白与不可溶蛋白（包涵体）的分离
• 3.2.4 包涵体的变性及复性
• 3.2.5 单克隆抗体的制备
• 3.2.6 单克隆抗体的鉴定
• 3.2.7 单抗竞争ELISA方法的建立
• 3.2.8 单抗竞争ELISA方法的临床应用
• 4 结果与分析
• 4.1 重组蛋白的提取
• 4.2 PMT-C和PMT-N间接ELISA方法的确定
• 4.3 单克隆抗体的制备
• 4.3.1 细胞融合后结果的观察
• 4.3.2 融合后筛选及克隆化培养结果
• 4.4 单抗的鉴定
• 4.4.1 Western-blot鉴定
• 4.4.2 单抗中和活性的测定
• 4.4.3 染色体计数结果
• 4.4.4 单抗的效价（腹水）、Ig亚型及相对亲和力的测定
• 4.4.5 单抗的表位分析
• 4.4.6 稳定性检测
• 4.5 单抗竞争ELISA方法的建立
• 4.5.1 单抗的纯化
• 4.5.2 抗原包被浓度和酶标抗体工作浓度
• 4.5.3 血清最适稀释度的选择
• 4.5.4 阴阳界线的确定
• 4.5.5 封闭液的选择
• 4.5.6 血清稀释液的选择
• 4.5.7 血清温育时间的选择
• 4.5.8 特异性试验
• 4.5.9 敏感性试验
• 4.5.10 批内重复性试验
• 4.5.11 批间重复性试验
• 4.5.12 符合试验
• 4.6 单抗竞争ELISA检测方法的临床初步应用
• 5 讨论
• 5.1 关于单抗的制备
• 5.2 关于单抗竞争ELISA方法的建立及初步应用
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录