论文摘要
目的：本实验诱导健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell（s），PBMC）分化为树突状细胞（dendritic cell，DC），然后从DC中扩增B7h基因，构建人B7h基因原核表达载体，并转化入E. coli BL21（DE3）中进行B7h重组蛋白表达。重组B7h蛋白对研究ICOS／B7h途径在体内信号传导中的作用具有重要的意义，并为下一步制备B7h单克隆抗体奠定实验基础。方法：1．用人淋巴细胞分层液从健康人外周血白膜中分离出PBMC，然后给予IL-2、IL-4和GM-CSF诱导PBMC分化为DC。用Trizol试剂提取DC的总RNA，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人DC中扩增出B7h基因。2．利用TA克隆技术，将B7h基因与T载体pTZ57R／T进行连接，转化入E. coli JM109，构建pTZ57R／T-B7h。经蓝白斑筛选后，抽提质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序。3．将测序正确的pTZS7R／T-B7h用NotⅠ／EcoRⅠ双酶切，将所得B7h片段与同样经NotⅠ／EcoRⅠ双酶切的原核表达载体pGEX-4T-1连接，转化E. coli DH5α，构建pGEX-4T-1-B7h重组质粒。随机挑选白色菌落，抽提质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定和DNA测序。将重组质粒pGEX-4T-1-B7h转化表达宿主菌E. coli BL21（DE3），用IPTG诱导促进B7h融合蛋白表达，对表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western Blot）鉴定。结果：1．将人DC细胞中B7h基因的PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，产物为单一、清晰条带，大小约为909bp。2．对pTZ57R／T-B7h和pGEX-4T-1-B7h分别进行PCR鉴定、酶切鉴定及DNA序列分析。PCR鉴定和酶切鉴定都表明B7h cDNA为909bp的DNA片段。两个重组质粒测序结果相同，且与文献报道的B7h基因序列有99.6％一致性，证实pTZS7R／T-B7h和pGEX-4T-1-B7h重组质粒构建成功。3．将重组质粒pGEX-4T-1-B7h转化入E. coli BL21（DE3），表达产物在SDS-PAGE上表现为相对分子质量（Relative molecular mass，Mr）约为56kD左右的融合蛋白，与预期的结果相符。在Western Blot实验中，与抗人B7h单克隆抗体反应，出现特异性条带，更进一步确定了B7h重组蛋白的表达。结论：1．本实验克隆的基因为人B7h基因。2．重组质粒pGEX-4T-1-B7h是具有表达功能的原核表达系统。3．pGEX-4T-1-B7h转化E. coli BL21（DE3），其表达产物是B7h融合蛋白。