论文摘要
同型半胱氨酸诱导的ERK调节作用与上皮生长因子受体的间接激活目的高同型半胱氨酸血症与多种神经系统疾病有关，同型半胱氨酸（Hcy）在脑内积聚，成为潜在的神经毒素。然而，Hcy水平的升高对神经细胞影响的机制目前尚不清楚。在本实验中，我们通过对小鼠原代小脑颗粒神经元细胞体外培养，并加入Hcy等药物干预，来研究Hcy与神经细胞上皮生长因子受体间接激活信号传导途径之间的关系。方法选取出生7天CD—1小鼠，进行小脑颗粒神经元原代培养，无菌操作，取出小脑，去除脑膜，切碎，在不含钙镁的胰蛋白酶中消化3分钟，1500r／min离心7分钟，移入到细胞培养液，培养液成分为Dulbecco’s培养基（DMEM），用200目筛网过滤，种植到多聚赖氨酸处理的培养皿中，放入37℃、5％CO2培养箱贴壁15分钟。然后换含10％马血清的细胞培养液。24小时后，加入40μM阿糖胞苷。置37℃5％CO2温箱每日观察。培养7天神经元细胞，随机分四组：生理盐水对照组、AG1478对照组、Hcy处理组、AG1478和Hcy处理组。换成无血清培养液后，加入Hcy，20分钟。对于AG1478和Hcy处理组，先加入AG1478（1μM），15min，再加入Hcy（100μM），20分钟。每35mm皿加100μL蛋白提取液，收集细胞，进行免疫印记检测。用流式细胞仪分析细胞凋亡率时，培养7天神经元细胞，按上述方法随机分四组加药，温箱孵育6小时。采用Western印迹法半定量测定ERR1／2磷酸化，50μg神经元样品做SDS-PAGE电泳（浓缩胶浓度为5％，分离胶为10％），转入硝酸纤维膜（NC）上，5％的脱脂牛奶封闭1小时。用p-ERK或ERK一抗在室温中孵育2小时。洗膜四次（时间分别为5分钟、5分钟、10分钟、20分钟）后用羊抗鼠（p-ERK）IgG HRP或羊抗兔（ERK）IgG HRP二抗孵育。用ECL（Amersham Biosciences，Buchinghamshire，UK）显色，并在胶片上感光。显出的色带用扫描仪扫描，用Window AlphaEase TM FC 32-bit分析软件进行灰度分析。采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。药物处理6小时后，分析细胞凋亡率。将细胞轻轻吹起，离心后收集细胞，用PBS冲洗，75％酒精保存过夜，在流式细胞仪分析前30分加入PI（10μg／ml）。结果Hcy可以引起ERK1／2磷酸化，并且这一反应可以被上皮生长因子受体特异性拮抗剂AG1478所阻断。本实验中，在培养7天的小鼠小脑颗粒神经元中加入Hcy（0.1mM），20分种后行Western印迹法检测，可见磷酸化的ERK1／2同盐水对照和AG1478对照组相比明显增加，而经过AG1478预处理15分种后再加入Hcy（0.1mM）的试验组则与同盐水对照和AG1478对照组相比无明显差异。以上结果来自4次重复试验所得结果的均值，p＜0.05。Hcy可以诱导小鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡，当预先加入AG1478后，小鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡率明显增加。在培养7天的小鼠小脑颗粒神经元中加入Hcy（0.3mM）6小时后，通过流式细胞仪可以检测到明显的细胞凋亡；当AG1478预处理15分钟后再加入Hcy（0.3mM）时，6小时后检测出的细胞凋亡率又明显高于单纯加入Hcy组；盐水对照和AG1478对照组无明显细胞凋亡。以上结果来自4次重复试验所得结果的均值，p＜0.05。结论在小鼠小脑颗粒神经元Hcy毒性试验中，Hcy可以间接激活上皮生长因子信号传导途径，引起ERK1／2磷酸化；并且，这一间接激活途径可能具有神经保护作用。
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