PMI/甘露糖选择体系在大麦转基因中的应用

论文摘要

大麦是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的主要禾谷类作物,无论种植面积还是产量都居第4位,在世界农业生产中具有重要意义。大麦赤霉病是世界温暖潮湿和半潮湿麦区的主要病害之一,也是我国长江中下游麦区及华南麦区的重要病害,不仅能导致产量的大幅度下降,还直接影响籽粒加工和营养品质;病麦粒用于酿造或食用还会影响人类健康,因此在育种目标上除要求高产优质外,抗赤霉病也是赤霉病流行地区大麦主要育种目标之一。本研究以大麦幼胚愈伤组织作为转化受体,采用农杆菌介导法将抗菌肽基因转入培养细胞,并且以pmi基因作为选择标记,经甘露糖筛选获得T0代抗性植株,进行氯酚红显色（CPR）、PCR以及Southern检测,证实了外源基因的整合和表达。获得的主要结果如下:1.对3个大麦品种的幼胚愈伤组织进行转化,其中鄂大麦7号和花30没有得到转化植株,早熟3号得到228棵抗性植株,其中有71株表现为PCR阳性,转化率达到3.06%。结果表明,大麦基因型和甘露糖筛选浓度是影响转化率的主要因素,大麦不同基因型对农杆菌的敏感程度不同。2.转化过程中辅助使用超声波和真空处理可以提高转化效率。农杆菌浸染受体细胞时,分别用超声波处理30 s或真空处理15 min（真空度为80 kPa）,浸染时间30 min,结果表明,与不采用辅助手段转化的对照相比,辅助手段处理可不同程度的提高转化效率,其中以真空处理最为明显。3.高渗处理农杆菌浸染前的外植体可提高转化效率。比较3种不同高渗处理时间（5 h、12 h和26 h）对转化率的影响分析表明:随着高渗时间的延长,得到的转化植株数量降低,高渗5 h最高,可见高渗处理会降低植株的再生能力。同时统计CPR阳性率表明,适当延长高渗时间可提高植株的阳性率,高渗12 h最高,其次是26 h,5 h最低。4.愈伤组织在经过20 g/L甘露糖和25g/L甘露糖2个阶段的诱导筛选后进入分化阶段,比较了它们在3种不同甘露糖浓度下的成苗率及氯酚红显色反应（CPR）。结果表明,非转化的愈伤组织在3种培养基上的成苗率随着甘露糖浓度的增加而逐渐降低,都在2%左右,可见甘露糖会抑制愈伤的分化。而转化的愈伤组织在20g/L甘露糖的分化培养基上成苗率最高,浓度升高或降低都会降低成苗率。分析CPR阳性率也表明,甘露糖浓度为20g/L阳性率最高,这个结果与成苗率一致。综合以上结果说明,在愈伤分化阶段20 g/L甘露糖为最佳筛选压。5.氯酚红显色反应是鉴定PMI活性的快速有效方法。本实验中采用氯酚红显色反应对转化植株进行初步鉴定,在甘露糖浓度为15g/L、蔗糖浓度为15g/L、氯酚红浓度为100 mg/ml的条件下的检测效果最好。对228棵植株进行CPR检测,有150株表现为阳性,阳性率为65.7%;然后对其进行PCR检测,有71株表现为阳性,阳性率为31.1%。并通过后续的Southern检测对转化植株进行了进一步的鉴定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1.前言
• 1.1 大麦遗传转化方法
• 1.1.1 农杆菌介导法
• 1.1.2 基因枪法
• 1.1.3 PEG法
• 1.1.4 显微注射法
• 1.2 转基因植物的安全性问题
• 1.2.1 标记基因的安全性问题
• 1.2.2 安全标记基因
• 1.3 甘露糖筛选
• 1.3.1 6-磷酸甘露糖异构酶基因
• 1.3.2 pmi基因在转基因植物筛选中的应用
• 1.3.3 PMI转基因植株的检测
• 1.3.4 PMI/甘露糖筛选体系的生物安全评估
• 1.3.5 对pmi基因作为选择标记基因的评价
• 1.4 研究目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 主要生化试剂
• 2.1.4 培养基、试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大麦幼胚灭菌
• 2.2.2 转化农杆菌
• 2.2.3 菌体PCR方法鉴定转化子
• 2.2.4 农杆菌介导的幼胚愈伤组织转化
• 2.2.5 大麦幼胚愈伤组织的筛选及再生植株的移栽
• 2.2.6 转化苗的鉴定
• 2.2.7 甘露糖对未转化植株种子成熟胚的筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 菌体PCR鉴定转化子
• 3.2 转化植株的获得
• 3.3 甘露糖对愈伤组织分化和生根的影响
• 3.4 高渗时间对转化的影响
• 3.5 辅助使用超声波和真空渗入处理对转化的影响
• 3.6 分化阶段不同筛选压对转化的影响
• 3.7 氯酚红显色反应
• 3.8 PCR鉴定转化植株
• 3.9 Southem杂交
• 3.10 甘露糖对未转化植株种子成熟胚的筛选
• 4 讨论
• 4.1 大麦转化中标记基因的应用
• 4.2 甘露糖筛选体系的优化
• 4.3 氯酚红显色法快速鉴定转化植株
• 4.4 农杆菌转化过程中不同品种间的差异
• 参考文献
• 致谢