大菱鲆耐低温性状相关表型遗传特征及生理生化指标研究

论文摘要

本文研究了不同表型特征大菱鲆的耐低温能力,发现不同表型的大菱鲆具有不同的低温耐受能力;在此研究背景下,利用两种不同性状的大菱鲆亲本进行自交和杂交,观察子代的受精率、孵化率、体色分离和体型差异,以期能为大菱鲆的杂交育种和养殖提供基础的资料;血清的生理生化指标是反映动物在环境应激时体内物质代谢和组织器官机能状态变化的一个重要特征,本研究对两种不同表型性状的大菱鲆在不同低温胁迫后血清生化指标的差异进行了分析;并采用AFLP技术寻找和大菱鲆体表带点性状相关的分子标记,获得与带点性状有相关性的引物组合E1/M1。为进一步获得与耐低温相关的分子标记,本研究采用双向电泳技术从差异蛋白质组学的角度对低温胁迫后大菱鲆进行研究,以期为鱼类的抗寒研究提供基础资料,并为大菱鲆低温选育工作提供理论依据。具体实验结果如下:设计8℃、5℃、3℃、0℃四个低温梯度,对两种不同表型性状的大菱鲆进行耐低温实验。结果表明8℃、5℃、3℃低温胁迫十天后体表带星点和不带星点实验鱼均无死亡; 0℃低温胁迫后两种表型性状的大菱鲆出现死亡差异,体表带星点的大菱鲆具有更强的低温耐受能力。投喂实验表明大菱鲆在四个低温梯度胁迫十天内均无摄食。挑选体表带星点性状H和不带星点性状D亲鱼进行自交和杂交,获得4种子代: HH,DD,HD（HH×DD ）,DH（DD×HH ）,观察子代的受精率、孵化率、体色分离和体型差异。结果表明: （1） HH自交的受精率最高,是91.67%;孵化率仅次于DH（DD×HH ）;（2）经过统计学分析自交和杂交组合后代,不同性状H和D并没有严格符合性状遗传定律,说明此性状并不是由一对等位基因控制; （3）在自交和杂交四个组合中,DD自交体长/全长,体重/全长,体高/体长均与其它三个组合差异显著（P<0.05）, DH杂交的体重/全长与DD和HD差异显著（P<0.05）。研究选育家系中不同表型大菱鲆在8℃、5℃、3℃和0℃低温胁迫下血清pH及血清中AST、ALT、Cl-和K+的水平差异。结果显示:在低温胁迫后,pH均出现先升高后降低的趋势,在5℃、3℃和0℃条件下,带星点实验鱼比不带点实验鱼pH的变化幅度小;24h内带星点实验鱼的K+先升高后降低,且波动幅度带星点实验鱼大于不带点实验鱼;24h内,血清中Cl-呈波动变化,体表带星点与不带星点实验鱼差异不显著;低温胁迫后,大菱鲆血清AST的水平都显著升高,且带星点实验鱼血清中AST变化幅度小于不带星点的实验鱼;低温胁迫后血清ALT的水平都显著升高,带星点大菱鲆血清的ALT变化幅度较小于不带星点大菱鲆。血清生化指标的差异分析表明带星点家系大菱鲆具有更强的耐低温能力。采用AFLP技术筛选与选育家系中大菱鲆体表带星点性状相关的分子标记。摸索和建立了大菱鲆体表AFLP技术体系。设计选择性扩增引物16对,发现引物组合E1/M1在两种性状中存在差异条带,通过对差异条带的回收和克隆测序,结果表明该差异基因与NCBI已报道的基因的同源性都不高,推测这可能是一个未知基因,且该基因与大菱鲆体表带点性状具有一定的相关性。对大菱鲆（Scophthalmus maximus）进行3℃急性低温胁迫处理,利用双向电泳技术,对低温胁迫组和常温对照组的机体表皮蛋白组图谱差异比较分析。结果表明共有19个蛋白点在低温胁迫后发生了显著变化。其中,表达下调的蛋白点有4个蛋白点;表达上调的蛋白点有8个;消失的蛋白点有2个;新增的蛋白点点有6个。从中挑选四个差异蛋白点进行肽指纹图谱（MALDI-TOF-MS）分析,结果显示:低温胁迫组的大菱鲆表皮MLC和Mimecan前体蛋白表达显著上调,而typeⅡ角蛋白表达显著下调,推测这些蛋白可能与大菱鲆耐低温调控有关,为大菱鲆耐温机理及耐温品系的选育提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 鱼类耐低温研究现状
• 1.1 营养学方面
• 1.2 神经系统和内分泌方面
• 1.3 新陈代谢方面
• 1.4 分子生物学方面
• 1.5 血清生化指标方面
• 第二节 鱼类体色调控研究现状
• 2.1 遗传因素
• 2.2 神经和内分泌因素
• 2.3 饲料对体色的影响
• 2.4 环境对体色的影响
• 第三节 本研究课题的目的和意义
• 第二章 大菱鲆低温胁迫试验及体表遗传特征研究
• 引言
• 第一节 不同表型性状大菱鲆的耐低温差异研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 低温实验设计
• 2 结果与讨论
• 2.1 死亡率差异
• 2.2 低温胁迫后摄食观察
• 2.3 低温胁迫后恢复实验
• 第二节 大菱鲆不同表型亲本杂交子代的体色及体型研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 亲鱼交配设计和繁殖
• 1.2.2 饲养管理
• 1.3 数据处理及分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 自交及杂交组合的受精率和孵化率
• 2.2 体色的分离
• 2.3 四个组合的可量性状比较分析
• 3 讨论
• 3.1 体表带星点和不带星点大菱鲆
• 3.2 受精率和孵化率
• 3.3 体型分析
• 3.4 体色遗传规律
• 4 小结
• 第三章 低温胁迫对不同表型性状大菱鲆血清生化指标的影响
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 低温胁迫实验设计
• 1.4 样品采集
• 1.5 血清指标测定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同低温胁迫时间对两种不同型状大菱鲆血清pH 的影响
• 2.2 不同低温胁迫时间对两种不同型状大菱鲆血清离子的影响
• 2.2.1 血清中Cl-的变化
• 2.2.2 血清中K+的变化
• 2.3 不同低温胁迫时间对两种不同型状大菱鲆血清酶的影响
• 2.3.1 血清中谷丙转氨酶（ALT）活性的变化
• 2.3.2 血清中谷草转氨酶（AST）活性的变化
• 3 讨论
• 第四章 与大菱鲆体表表型性状相关的AFLP 分子标记研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 DNA 的提取
• 1.4.2 EcoRI 和MseI 接头及引物的合成
• 1.4.3 基因组DNA 的双酶切
• 1.4.4 酶切产物与接头的连接
• 1.4.5 预扩增反应
• 1.4.6 选择性扩增反应
• 1.4.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
• 1.4.8 差异条带回收
• 2 结果与讨论
• 2.1 DNA 质量检验与浓度测定
• 2.2 预扩增反应
• 2.3 差异片段比对
• 第五章 大菱鲆表皮蛋白质组双向电泳体系的建立及差异蛋白分析
• 引言
• 第一节 大菱鲆表皮蛋白质组双向电泳技术的建立及优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品采集
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验所需液体配置
• 1.2.2 蛋白样品的制备与定量
• 1.2.3 蛋白定量
• 1.2.4 双向电泳
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同蛋白提取方法对蛋白提取质量的影响
• 2.2 IPG 胶条pH 范围的选择
• 2.3 等电聚焦程序对大菱鲆表皮蛋白双向电泳图谱的影响
• 2.4 凝胶显影时间对结果的影响
• 2.5 IPG 胶条转移对双向电泳图谱的影响
• 3 小结
• 第二节 低温胁迫下大菱鲆表皮蛋白质组差异表达的双向电泳分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验鱼
• 1.2 低温胁迫实验设计与取样
• 1.3 试剂与仪器
• 1.4 蛋白样品的制备与定量
• 1.5 双向电泳
• 1.6 染色、扫描及图像分析
• 1.7 质谱鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 低温胁迫下大菱鲆表皮蛋白双向电泳图谱分析
• 2.2 低温胁迫下大菱鲆表皮差异蛋白点质谱分析及数据库搜寻比对
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢