猪常见病毒病诊断基因芯片的构建与初步应用

论文摘要

混合感染已经成为猪群发病的普遍现象,使病情更为复杂,增加了临床和实验室诊断难度,因此有必要建立一种一次多元的检测方法。基因芯片在病原体检测方面具有独特的优势,它以高通量并行检测的方式,可以使病料中的多种病原体同时被检出,具有快速、高效、灵敏的特点,尤其适宜于大规模的样本检测。本研究采用基因芯片技术,借助多重PCR和核酸标记技术,构建了猪病毒性呼吸道病诊断基因芯片和猪病毒性繁殖障碍病诊断基因芯片,用于混合感染病料的检测,具有同步检测和鉴别诊断的功能。主要研究内容如下:试验一探针的克隆与鉴定根据Genbank收录的PRRSV、CSFV、PCV-2、PPV、PRV、JEV和A型流感病毒核酸序列,针对不同病毒的保守区设计引物。用高保真DNA聚合酶扩增病毒DNA或cDNA,得到了7种病毒的特征性核酸片段,纯化后与载体pMD18-T Simple Vector连接,构建重组质粒。PCR和测序鉴定结果证明,重组质粒构建成功。多序列同源性比较结果显示,探针序列与相关病毒分离株的同源性为89100%。重组质粒的成功构建为基因芯片探针的制备提供了可靠、稳定的材料来源,保证了芯片检测的特异性。试验二猪病毒性呼吸道病诊断基因芯片的构建和初步应用以试验一构建的重组质粒制备PRRSV、PRV、PCV-2和SIV探针,制备猪病毒性呼吸道病诊断基因芯片。Biotin-11-dUTP使用浓度的选择:在PCR扩增过程用Biotin-11-dUTP替代部分dTTP对靶片段进行标记,扩增体系中Biotin-11-dUTP的终浓度分别为40μM、50μM、70μM和100μM。检测结果显示,4个浓度体系的产物都可以得到杂交信号,而且杂交信号随着浓度的递增而增强。70μM（替代35%的dTTP）的终浓度可以满足检测分析的要求。杂交温度的选择:S、PRRSV、PRV、PCV-2、SIV的靶片段分别在37℃、42℃、50℃和55℃四种不同的杂交温度条件下与芯片杂交。检测结果表明,各探针和阳性对照位点在不同温度条件下都有杂交信号,但多数在42℃条件下获得较高的SNR值。各靶片段在不同温度条件下与其它探针之间无交叉杂交信号。杂交时间的选择:在40min、1h、1.5h和2.0h不同杂交时间内,各靶片段与芯片的杂交结果显示,随着杂交时间的延长杂交信号有增强的趋势。杂交时间为1h时,各探

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 多病原混合感染
• 2 猪病毒性繁殖障碍病
• 3 猪病毒性呼吸道疾病
• 4 基因芯片技术及其在病毒研究中应用
• 4.1 基因芯片技术简介
• 4.2 基因芯片技术在病毒研究中的应用
• 5 本研究的目的意义
• 试验一 基因芯片探针和定位对照基因的克隆和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 E.coli JM109
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 病毒核酸的提取
• 1.2.3 病毒cDNA 的合成
• 1.2.4 病毒核酸片段的 PCR 扩增
• 1.2.5 病毒核酸片段的切胶回收
• 1.2.6 病毒核酸片段与克隆载体的连接
• 1.2.7 感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接载体的转化
• 1.2.9 重组质粒的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒核酸片段的 PCR 扩增结果
• 2.2 重组质粒 PCR 鉴定结果
• 2.3 重组质粒测序鉴定结果
• 试验二 猪病毒性呼吸道疾病诊断基因芯片的构建和初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 重组质粒
• 1.1.3 膜介质
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 芯片杂交主要试剂
• 1.1.6 其它主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 定位对照基因和探针的制备
• 1.2.2 猪呼吸道疾病诊断基因芯片的制备
• 1.2.3 基因芯片检测过程
• 1.2.4 Biotin-11-dUTP 使用浓度的选择
• 1.2.5 芯片杂交温度的选择
• 1.2.6 芯片杂交时间的选择
• 1.2.7 点样探针浓度的选择
• 1.2.8 芯片检测特异性试验
• 1.2.9 芯片检测灵敏性试验
• 1.2.10 芯片检测重复性检验
• 1.2.11 芯片临床应用
• 2 结果与分析
• 2.1 探针纯化结果
• 2.2 Biotin-11-dUTP 使用浓度的确定
• 2.3 不同温度下芯片杂交结果
• 2.4 不同杂交时间芯片杂交结果
• 2.5 不同探针浓度芯片的杂交结果
• 2.6 芯片检测特异性试验结果
• 2.7 芯片检测灵敏性试验结果
• 2.8 芯片检测重复性检验结果
• 2.9 临床组织病料检测结果
• 试验三 猪病毒性繁殖障碍病诊断基因芯片的构建和初步应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 定位对照基因和探针的制备
• 1.2.2 猪病毒性繁殖障碍病诊断基因芯片的制备
• 1.2.3 基因芯片检测过程
• 1.2.4 芯片检测特异性试验
• 1.2.5 芯片检测灵敏性试验
• 1.2.6 芯片检测重复性检验
• 1.2.7 芯片临床应用
• 2 结果与分析
• 2.1 探针纯化结果
• 2.2 芯片检测特异性试验结果
• 2.3 芯片检测灵敏性试验结果
• 2.4 芯片检测重复性检验结果
• 2.5 临床组织病料检测结果
• 3 讨论
• 3.1 关于探针和靶标的定义
• 3.2 病毒探针的选择和引物设计
• 3.3 探针的克隆
• 3.4 芯片设计
• 3.5 芯片的制备
• 3.6 标记方法
• 3.7 芯片检测分析
• 3.8 多重PCR
• 3.9 芯片本底的控制
• 3.10 提高杂交速率
• 3.11 芯片检测的可重复性
• 3.12 芯片检测的临床应用
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况