应用抑制性消减杂交技术筛选p7TP3剪切体1反式激活基因

论文摘要

丙型肝炎病毒（HCV）的p7蛋白是存在于HCV结构蛋白和非结构蛋白之间的63个氨基酸残基组成的一个小蛋白,它在脂质膜中形成阳离子通道。p7蛋白对病毒颗粒感染性的产生是必需的。利用基因芯片技术对p7蛋白表达载体转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2的基因表达谱变化进行了比较,发现p7蛋白可以反式调节某些基因的表达,其中包括一个未知功能基因,命名为p7TP3。在研究p7TP3基因的过程中,发现了p7TP3基因的不同剪切体,对p7TP3基因组进行分析,确定了p7TP3剪切体1的编码序列。为进一步探讨p7TP3剪切体1基因在HCV致病过程中的作用,我们进行了如下研究:1.采用RCR技术克隆扩增p7TP3剪切体1,并以T-A克隆法,将p7TP3剪切体1基因片段连入载体pGEM-T,经EcoR I和BamH I双酶切鉴定以及测序分析,成功克隆了p7TP3剪切体1基因。2.构建荧光表达质粒pEGFP-C1-p7TP3剪切体1,瞬时转染HepG2细胞,并以空载体pEGFP-C1作为平行对照,检测p7TP3剪切体1的细胞内定位。荧光显微镜下观察发现,荧光表达质粒pEGFP-C1-p7TP3剪切体1瞬时转染HepG2细胞后,发现其亚细胞定位于细胞浆中。3.构建真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his-p7TP3剪切体1 ,以表达质粒pcDNA3.1/myc-his-p7TP3剪切体1瞬时转染HepG2细胞,并以空载体pcDNA3.1/myc-his作为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,应用抑制性消减杂交技术,构建p7TP3剪切体1反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选相关的靶基因片段,将产物与pGEM-Teasy载体连接,转染E. coli大肠杆菌系统进行文库扩增,随机挑选克隆,PCR扩增后进行测序及同源性分析,筛选得到14种上调基因。结果表明:（1）p7TP3剪切体1蛋白具有反式调节功能。（2）筛选得到的cDNA全长序列,包括一些与细胞内信号转导、细胞生长调节、蛋白质翻译合成、物质代谢、细胞凋亡、免疫调节及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了p7TP3剪切体1在肝细胞内可能存在的调控机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 第一章 丙型病毒性肝炎发病机制中的反式调节机制
• 1.1 功能基因组学
• 1.1.1 主要研究内容
• 1.1.2 主要研究方法
• 1.1.3 功能基因组学与病毒性肝炎发病机制的关系
• 1.2 HCV 发病机制中的反式调节机制
• 1.2.1 HCV 的流行概况及传播途径
• 1.2.2 HCV 的治疗现状
• 1.2.3 HCV 的基因结构和分型
• 1.2.4 HCV 发病机制中的反式调节机制
• 试验研究
• 第二章 P7TP3 剪切体1 基因的克隆
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因引物设计与合成
• 2.2.2 PCR 扩增基因片段
• 2.2.3 PCR 产物回收
• 2.2.4 连接反应
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 细菌质粒提取（碱裂解法）
• 2.2.7 酶切鉴定
• 2.2.8 DNA 序列测定
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 P7TP3 剪切体1 的亚细胞定位
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 荧光表达载体的构建
• 3.2.2 细胞转染
• 3.3 结果
• 3.3.1 真核表达重组载体的酶切鉴定
• 3.3.2 重组质粒在HepG2 细胞中表达
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 应用SSH 筛选P7TP3 剪切体1 反式激活基因
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 真核表达载体的构建
• 4.2.2 细胞转染
• 4.2.3 mRNA 提取
• 4.2.4 单链cDNA（sscDNA）和双链cDNA（dscDNA）的合成
• 4.2.5 Rsa I 消化
• 4.2.6 连接接头
• 4.2.7 第一次杂交
• 4.2.8 第二次杂交
• 4.2.9 PCR 扩增
• 4.2.10 连接效率分析
• 4.2.11 消减效率分析
• 4.2.12 PCR 产物的纯化
• 4.2.13 cDNA 消减文库的建立及差异表达基因克隆
• 4.3 结果
• 4.3.1 真核表达重组载体的酶切鉴定
• 4.3.2 mRNA 的定性分析
• 4.3.3 连接效率检测
• 4.3.4 消减效率分析
• 4.3.5 差异表达cDNA 片段的扩增及克隆
• 4.3.6 cDNA 测序与同源性分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介