鸡Mx基因的克隆、表达及其抗病活性的研究

论文摘要

Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠抗流感病毒试验时发现的,因能抵抗粘液病毒而命名为Mx（myxovirus resistant）基因。关于禽类Mx蛋白的研究,1992年首次发现了鸭的Mx蛋白后,鸡的Mx蛋白基因也被克隆,鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影响,当631位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性,为丝氨酸时则无抗病毒活性。但将鸡Mx蛋白用于提高鸡体免疫力的研究还鲜见报道,本研究拟探索通过对同种异体鸡Mx基因进行改造构建鸡抗病毒重组基因、表达抗病毒蛋白的思路,旨意在从提高鸡自身抗病毒能力上应对禽类病毒病的威胁探索新思路。主要研究如下:1.以50μg/mL Poly（I）?Poly（C）诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,7小时后提取细胞总RNA,根据发表文献设计一对扩增全长Mx cDNA特异性引物,采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果:与GenBank发表的鸡Mx cDNA序列AB088535、AY695797、NM204609、XM429240、Z23168的同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.7%、99.4%,说明所扩增的序列为本实验所要的。获得的鸡Mx cDNA序列在2032位碱基为G,该基因的抗病毒活性还需做进一步研究。2.采用简单易行的大引物PCR突变技术将鸡Mx基因的全长cDNA第2032位的碱基由G突变为A（既631位氨基酸的改变）,并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3.0,重组表达载体经PCR、酶切鉴定验证构建正确后,提取并纯化重组质粒。采用脂质体法转染COS-Ⅰ细胞,RT-PCR与间接免疫荧光（IFA）鉴定其表达。然后提取并纯化转染Mx基因的COS-Ⅰ细胞裂解液,采用NDV-CEF微量细胞抑制试验,进一步确定Mx蛋白的抗病毒活性。结果:对鸡Mx基因进行PCR诱变修饰正确,构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体。微量细胞抑制试验分析结果显示,重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒生物活性。3.以酶切线性化的重组质粒为目的基因,直接将目的基因通过随机打点法注射入睾丸,转染SSCs,产生携带有目的基因的成熟精子用于生产转基因鸡。采用常规PCR检测技术,在DNA分子水平检测证实外源基因（Mx）的整合。结果:PCR检测证实外源基因（Mx）已整合到精子基因组,且能通过体外受精在后代中稳定整合,后代PCR检测的阳性率为27.27%（6?22）。表明睾丸内注射法可能是一种切实可行、简单并利于推广的制备大群转基因鸡的方法。关于重组Mx蛋白的其它抗病毒活性与抗病转基因鸡实验正在研究之中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一篇 文献综述
• 禽类Mx 蛋白与抗病育种的研究进展
• 1 Mx 蛋白的发现
• 2 不同动物的Mx 蛋白
• 3 Mx 蛋白的结构与功能
• 4 Mx 蛋白的表达调控
• 5 Mx 蛋白的抗病毒活性
• 6 禽类Mx 蛋白的研究进展
• 7 动物抗病性的遗传基础
• 8 抗病育种存在的问题
• 9 抗病育种的途径
• 10 精原干细胞
• 11 精原干细胞在转基因技术中的应用
• 12 研究展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 实验一 鸡Mx 基因全长cDNA 序列的克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种及试剂
• 1.2 受精蛋
• 1.3 成纤维细胞的制备与培养
• 1.4 Mx 蛋白的诱导
• 1.5 RNA 的提取
• 1.6 RT-PCR 扩增
• 1.7 Mx cDNA 的克隆
• 1.8 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 鸡成纤维细胞总RNA 的提取
• 2.2 鸡全长Mx cDNA 的扩增
• 2.3 测序结果
• 2.4 序列分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验二 鸡Mx 蛋白基因的修饰、表达及抗病活性的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 引物设计
• 1.4 PCR 诱变修饰
• 1.5 表达载体的构建
• 1.6 脂质体法转染细胞
• 1.7 Mx 基因转染COS-Ⅰ细胞
• 1.8 RT-PCR 检测Mx 的表达
• 1.9 IFA 检测转染Mx 蛋白基因的表达
• 1.10 新城疫病毒接种细胞
• 50 测定'>1.11 新城疫病毒TCID₅₀测定
• 1.12 抗新城疫病毒活性的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 诱变修饰
• 2.2 真核表达载体的构建
• 2.3 RT-PCR 检测Mx 的表达
• 2.4 IFA 检测转染Mx 蛋白基因的表达
• 50 测定'>2.5 新城疫病毒TCID₅₀测定
• 2.6 抗新城疫病毒试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 实验三 精原干细胞体内介导Mx 基因生产转基因鸡的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 转染液制备
• 1.4 睾丸内注射pcDNA3.0-MMx 质粒DNA 片段
• 1.5 转染公鸡日常活动观察和鸡精子常规检测
• 1.6 人工授精
• 1.7 PCR 检测
• 1.8 统计方法
• 2 结果与分析
• 2.1 pcDNA3.0-MMx 质粒线性酶切
• 2.2 转染公鸡精子常规检测结果
• 2.3 转染精子检测
• 2.4 转基因F1 代检测
• 2.5 阳性转基因F1 代检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文目录