高通量异源表达技术及其在链霉菌次级代谢调控研究中的应用

论文摘要

链霉菌中抗生素的生物合成受控于细胞内的调控基因,包括全局性调控基因和途径专一性调控基因。为了从棒状链霉菌NRRL 3585中寻找全局性调控基因,我们构建了棒状链霉菌的cosmid基因组文库。文库中共有2400个克隆(覆盖了基因组7倍)。基因组文库的宿主菌是一株含有接合转移帮助质粒pUZ8002的大肠杆菌。这一独创设计使这个大肠杆菌既可以当做文库的宿主菌,又可以直接作为接合转移的供体菌。用高通量接合转移的方式将基因组文库高效的转移到变铅青链霉菌中去异源表达。利用变铅青链霉菌中含有的两个几乎沉默的抗生素合成基因簇——放线紫红素基因簇和钙依赖抗生素基因簇作为报告系统来筛选文库中的调控基因。文库中有许多cosmid都能使变铅青链霉菌中的放线紫红素和钙依赖抗生素产量提高,这说明这些cosmid中可能含有控制抗生素产量的正调控基因。从这些cosmid中我们找到了一个来自棒状链霉菌的全局性调节因子AfsR。将afsR克隆下来重新接合转移到棒状链霉菌中,使其拷贝数增加。增加了afsR拷贝数的棒状链霉菌克拉维酸的产量提高了5倍,同时一个沉默的全霉素的基因簇也被激活了。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 链霉菌简介
• 1.1.1 变铅青链霉菌（S.lividans 1326）简介
• 1.1.2 棒状链霉菌（S.clavuligerus NRRL3585）简介
• 1.2 链霉菌中已知的基因簇和化合物数目的不匹配关系
• 1.3 寻找微生物来源的天然产物的策略
• 1.4 链霉菌中调控系统的研究
• 1.5 链霉菌接合转移简介
• 1.6 本课题研究的理论依据,目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒与引物
• 2.3 培养基与生化试剂
• 2.4 基本实验操作
• 2.4.1 菌种培养及保藏
• 2.4.2 大肠杆菌质粒的抽提
• 2.4.3 链霉菌总DNA的小量提取
• 2.4.4 酶连反应
• 2.4.5 DNA片段凝胶回收
• 2.4.6 PCR及相关技术
• 2.4.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化
• 2.4.8 PCR-targeting中大肠杆菌电转化感受态的制备及电转化
• 2.4.9 大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间接合转移
• 2.5 链霉菌cosmid基因组文库构建
• 2.5.1 质粒载体的制备
• 2.5.2 棒状链霉菌NRRL3585基因组DNA的制备
• 2.5.3 回收片段与载体的连接
• 2.5.4 连接产物的包装
• 2.5.5 包装产物的转染
• 2.6 高通量接合转移
• 2.7 生物测定
• 2.8 阳性克隆测序
• 2.9 构建afsR表达载体pHL851
• 2.10 棒酸的发酵,检测,HPLC
• 2.11 全霉素的发酵,抽提和检测
• 3 结果与分析
• 3.1 S.clavuligerus NRRL 3585 cosmid文库大肠杆菌宿主的构建
• 3.2 S.clavuligerus NRRL 3585cosmid文库到S.lividans 1326的高通量接合转移
• 3.2.1 宿主的选择
• 3.2.2 接合转移的过程
• 3.3 生测及表型观察
• 3.4 蓝色表型的重复验证
• 3.5 六个阳性cosmid
• s.cla与afsR_s.c氨基酸序列比对'>3.6 afsR_s.cla与afsR_s.c氨基酸序列比对
• cla表达载体的构建'>3.7 afsR_cla表达载体的构建
• cla单基因对S.lividans 1326抗生素产量的影响'>3.8 afsR_cla单基因对S.lividans 1326抗生素产量的影响
• cla对克拉维酸产量的影响'>3.9 afsR_cla对克拉维酸产量的影响
• 3.10 S.clavuligerus::pHL851在SC培养基上产生了黄色化合物
• cla同源蛋白afsR-g'>3.11 棒状链霉菌中另外一个afsR_cla同源蛋白afsR-g
• 4 讨论
• 4.1 高通量接合转移的方法是非常高效的
• 4.2 E.coli XLUZ存在以下优点
• cla同时提高了棒状链霉菌中克拉维酸和全霉素的产量'>4.3 afsR_cla同时提高了棒状链霉菌中克拉维酸和全霉素的产量
• 4.4 afsR过量表达导致克拉维酸产生延迟
• 5 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利