Hox基因介导维生素A缺乏导致大鼠胚胎先天畸形的机制研究

论文摘要

1．目的通过建立维生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）及边缘性维生素A缺乏（marginally vitamin A deficiency，MVAD）雌性大鼠模型，观察不同程度维生素A缺乏对胚胎生长发育及先天畸形发生的影响，并通过孕早期补充适量维生素A观察干预效果；检测器官形成期胚胎组织5个Hox基因mRNA水平的表达；检测3种视黄酸受体（retinoic acid receptors，RARs）mRNA及蛋白水平的表达；俭测Hoxa5基因启动子上游DNA甲基化的程度及位点分布，阐明Hox基因介导维生素A缺乏导致大鼠胚胎发育毒性的分子机制，为维生素A缺乏引起先天畸形的防治提供理论依据。2．方法2．1动物模型建立及分组：通过饮食诱导建立维生素A缺乏及边缘性维生素A缺乏的雌性大鼠模型。将初断乳SD雌性大鼠按体重随机分为正常对照组（AN）、维生素A缺乏组（VAD）、边缘性维生素A缺乏组（MVAD），分别喂饲维生素A含量为0 IU／g、0．4 IU／g、4 IU／g的饲料。亲代鼠喂养10w后采集尾血，用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测血浆视黄醇浓度。将雌雄大鼠2：1合笼交配，次日晨查到阴栓者记为妊娠第0．5d（E0．5d）。将维生素A缺乏、边缘性维生素A缺乏两组交配成功的雌鼠在各组内按体重随机分为维生素A缺乏组（AD组）、维生素A缺乏妊娠0．5d（E0．5d）补充组（DS组）、边缘性维生素A缺乏组（AM组）、边缘性维生素A缺乏妊娠0．5d（E0．5d）补充组（MS组）。AD、AM组饲料同前，DS、MS组于E0．5d起喂饲维生素A含量为10 IU／g的饲料。2．2亲代大鼠及其E12．5d、E19．5d胚胎生长发育情况：记录各组大鼠体重、身长、尾长、每日进食量、受孕率、流产率、胚胎存活情况（活胎数、吸收胎数、死胎数）；观察E12．5d胚胎的外部形态；观察E19．5d胚胎的外部形态、内脏和骨骼畸形情况。2．3 RT-PCR检测各组E12．5d胚胎组织中Hoxa1、Hoxa2、Hoxa5、Hoxa9、Hoxa10基因mRNA水平的表达。2．4应用RT-PCR及western blot检测各组E12．5d胚胎组织3种视黄酸受体（RARα、RARβ、RARγ）mRNA及蛋白水平的表达。2．5应用重亚硫酸盐测序方法（Bisufite Sequence PCR，BSP）检测各组E12．5d胚胎组织Hoxa5基因启动子上游DNA甲基化的分布及程度；应用RT-PCR及western blot分别检测E12．5d胚胎组织中Hoxa5 mRNA及蛋白水平表达的变化。3．结果3．1 AD组雌鼠在喂养10w后出现明显的维生素A缺乏症状，如生长缓慢、少食少动、反应淡漠、胡须脱落、后肢麻痹、双眼畏光，严重者眼周出现血性分泌物甚至失明。AM组未出现明显的维生素A缺乏症状。至交配时（10w末），AD组及AM组雌鼠血浆视黄醇浓度低于AN组，差异具有统计学意义（P＜0．05，P＜0．01），且AD组及AM组雌鼠血浆视黄醇浓度均分别低于0．07μmol／L、0．7μmol／L，表明维生素A缺乏及边缘性维生素A缺乏雌性大鼠模型已经建立成功。3．2至交配时，AD组亲代大鼠的体重、身长、食物利用率及受孕率均低于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05）；AM组雌鼠的上述各指标与正常对照组相比无无统计学差异。与AN组相比，AD组E12．5d和E19．5d胚胎存活率降低，死胎率及吸收胎率增加，差异具有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05），而DS组的上述各指标与AN组相比，差异无统计学意义。与AN组相比，AM组的死胎率增加，活胎率降低，差异有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05），吸收胎率的差异无统计学意义，而MS组的上述各指标的差异与AN组相比差异无统计学意义。E12．5d时，AD组胚胎形态较小、发育不良，至E19．5d时全为吸收胎。AM组大鼠胚胎的各生长发育指标（t重、身长和尾长）显著性低于AN组（P＜0．01，P＜0．05），死胎率及畸胎率均高于AN组，差异有统计学意义（P＜0．01，P＜0．05），主要畸形包括脑水肿、突眼、小眼、皮下出血、内脏出血、骨骼发育不良（骨化迟缓）、脊柱侧弯、中轴骨骼向前同源转化等。DS组MS组胚胎各指标与AN组均无统计学差异。3．3 AD组E12．5d胚胎组织中Hoxa1、Hoxa2、Hoxa5、Hoxa9、Hoxa10基因mRNA水平的表达低于AN组（P＜0．01，P＜0．05）；AM组E12．5d胚胎组织中Hoxa1、Hoxa2、Hoxa5基因mRNA水平的表达低于AN组（P＜0．01，P＜0．05），而Hoxa9、Hoxa10基因mRNA水平表达与AN组比较无统计学差异。3．4 AD组E12．5d胚胎组织中3种视黄酸受体（RARα、RARβ、RARγ）基因mRNA及蛋白水平的表达均低于AN组（P＜0．01，P＜0．05）；AM组E12．5d胚胎组织中RARβ、RARγ基因mRNA及蛋白水平的表达低于AN组（P＜0．01，P＜0．05），而RARαmRNA及蛋白水平的表达与AN组比较无统计学差异。3．5 AD组及AM组E12．5d胚胎组织中Hoxa5基因启动子上游500 bp 34个甲基化位点的甲基化程度明显高于AN组与补充组（DS组和MS组），异常的甲基化位点多集中于9th-10th、12th-16th、20th-21st三个区域。4．结论维生素A对胚胎的正常发育至关重要。维生素A缺乏对胚胎具有显著的发育毒性，不能维持胚胎完整的发育过程，在妊娠中后期就可导致胚胎死亡；边缘性维生素A缺乏对胚胎具有较强的发育毒性，可导致胚胎生长发育迟缓和先天畸形，但亲代大鼠未见明显的缺乏症状，具有一定的隐蔽性；孕早期补充适量维生素A可有效改善维生素A缺乏及边缘性维生素A缺乏导致的胚胎发育毒性；维生素A缺乏及边缘性维生素A缺乏可能通过干扰视黄酸受体的正常表达，从而抑制Hox基因启动子上游区域在胚胎发育过程中的去甲基化作用，致使Hox基因在转录水平和翻译水平下调表达从而产生对胚胎的发育毒性。5．创新点5．1通过研究不同程度维生素A缺乏对大鼠胚胎视黄酸受体和多个Hox基因表达的影响，全面系统地探讨了维生素A缺乏特别是边缘性维生素A缺乏导致胚胎先天畸形的分子机理，完善了维生素A缺乏导致胚胎先天畸形的理论。5．2 DNA甲基化是胚胎发育过程中重要的一种表观遗传修饰。本次研究利用重亚硫酸盐测序法系统地检测了Hoxa5基因启动子上游区甲基化的程及度分布，首次揭示了维生素A缺乏可能干扰胚胎发育过程中去甲基化的作用，而导致胚胎多个系统的先天畸形；

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分 维生素A缺乏对大鼠胚胎发育毒性的研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 维生素A缺乏导致大鼠胚胎发育毒性的机制研究
• 第一节 Hox基因介导维生素A缺乏导致大鼠胚胎发育毒性的机制研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 维生素A缺乏导致大鼠胚胎oHx基因表达变化的机制研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 附录
• 致谢