传染性法氏囊病病毒野毒株的致弱与分子机理研究

论文题目: 传染性法氏囊病病毒野毒株的致弱与分子机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 崔言顺

导师: 张彦明,崔治中

关键词: 传染性法氏囊病病毒,基因高变区,致弱,分子机理,比色法

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3～6周龄雏鸡和青年鸡,除直接引起鸡死亡和生产性能下降外,还可导致感染鸡免疫抑制。IBDV属于双RNA病毒科(Birnaviridae)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)。IBDV是一种小的、无囊膜病毒,为双节段、双链RNA基因组,二十面体对称结构。基因组分为A节段和B节段,A节段编码VP2、VP3、VP4、VP5 4种蛋白,B节段编码VP1。VP2、VP3是病毒的主要结构蛋白,共同构成病毒的主要保护性抗原。其中VP2携带宿主保护性抗原决定簇,可以诱导产生保护性中和抗体,并且具有血清学特异性,其核苷酸和氨基酸的序列多变性与病毒特性密切相关,因此成为研究IBDV抗原性和致病性的主要目标。自20 世纪80 年代中后期,世界上先后出现了IBDV 变异株、超强毒株IBDV(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)。目前,IBDV 标准毒株、超强毒株、变异株在我国并存,给免疫防制带来了极大的困难。只有对IBDV 野毒株致病性和分子生物学特性进行测定,才能针对特定的发病情况使用特定的疫苗,做到有的放矢。雏鸡母源抗体的存在也是制定免疫程序时必须考虑的一个重要因素,免疫前,有必要对IBDV母源抗体的滴度进行准确的测定。已报道我国有多处养鸡场发生vvIBDV 感染。能否有效地将vvIBDV 致弱并且获得有较高免疫原性、无免疫抑制的弱毒株,是摆在IBDV 研究者面前的一个亟待解决的问题。vvIBDV 致弱的分子机理的研究,特别是对VP2 高变区的研究,将对vvIBDV 的发生、IBDV 毒力标记的确定、野毒株和疫苗株的有效鉴别以及加速野毒株的致弱进程等方面的研究起到极大的推动作用。针对近年来山东省的IBD 流行情况,本课题主要进行了以下研究: 1.对山东省暴发IBD 的现状进行了系统地分析。从山东省几个地市发生重大IBD疫情的鸡场采集病料,根据病鸡发病的流行病学和临床症状,结合病毒分离、组织病理学观察、电镜观察、琼脂免疫扩散试验、间接荧光抗体试验等结果,确定几个鸡场的疫情均是由感染IBDV 野毒引起,分离鉴定出4 个野毒株分别命名为IBDV SD0210、SD0208、SD0110 和SD0106;进一步测定不同滴度的病毒液对3～6 周龄SPF 鸡的致病性,结果表明分离的4 个野毒株都具有很高的致病性,可以称为vvIBDV;对VP2 高变区基因的序列分析表明,4 个野毒株均具有目前所认定的超强毒株的特征。这表明近几年来山东省一些鸡场严重的IBD 疫情是由vvIBDV 的出现造成的。2.对MTT 比色法用于检测病料中IBDV 在细胞培养物中的增殖情况进行了研究,并首次将MTT 比色法用于IBDV 的分离鉴定。IBDV 野毒株在CEF 细胞中初次增殖时通常无可见细胞病变。本研究用MTT 比色法检测病料在细胞培养物中是否有IBDV 增

论文目录:

中文摘要

英文摘要

文献综述

第一章 鸡传染性法氏囊病的研究进展

1.1 概述

1.2 IBDV 的病原特性

1.2.1 病原

1.2.1.1 病毒的结构

1.2.1.2 病毒的形态发生

1.2.1.3 病毒蛋白

1.2.2 血清型

1.2.3 培养特性

1.2.3.1 IBDV 在鸡胚上的增殖

1.2.3.2 IBDV 在细胞上的增殖

1.2.3.3 IBDV 在细胞中增殖的分子机制

1.2.4 抵抗力

1.3 IBD 的诊断

1.3.1 流行病学

1.3.2 临床症状

1.3.3 病理变化

1.4 IBD 的检测

1.4.1 病毒分离鉴定

1.4.2 免疫学试验及分子生物学检测

1.5 治疗

1.5.1 抗体治疗

1.5.2 西药治疗

1.5.3 中草药防制 IBD

1.6 IBD 免疫抑制

第二章 鸡传染性法氏囊病病毒变异分子生物学研究进展

2.1 病毒基因组结构

2.2 蛋白结构与功能

2.3 病毒抗原变异的分子基础

2.4 病毒毒力变异的分子基础

第三章 超强毒 IBD 的发生

3.1 超强毒 IBDV 的发生及其研究

3.1.1 超强毒 IBDV 的发生

3.1.2 vvIBDV 抗原变异

3.1.3 vvIBDV 致病型变化

3.1.4 vvIBDV 毒力标记

3.2 vvIBDV 毒株致弱和适应细胞培养

3.3 症状和病变

3.4 分子诊断工具

3.5 致病性和免疫抑制

3.6 预防与控制

第四章 鸡传染性法氏囊病防制的研究进展

4.1 常规疫苗免疫

4.2 新型传染性法氏囊病疫苗研究进展

4.2.1 基因工程疫苗

4.2.2 亚单位疫苗

4.2.3 载体疫苗

4.2.4 VP5蛋白缺失IBDV毒株

4.2.5 DNA 疫苗

4.3 免疫防制中存在的主要问题

4.3.1 IBDV的毒力标记尚未确定

4.3.2 血清型和毒力的分类发生混淆

4.3.3 疫苗的质量令人堪忧

4.3.4 综合防制措施有待进一步加强

试验研究

第五章 野毒株的分离鉴定

5.1 材料

5.1.1 标准SPF 鸡IBD 阳性血清

5.1.2 IBD 琼脂扩散试验抗原

5.1.3 荧光标记的 IBDV 特异性血清

5.1.4 SPF 鸡胚和 SPF 鸡

5.1.5 IBDV 病料采集及处理

5.2 方法

5.2.1 病毒的分离

5.2.1.1 病料的前处理

5.2.1.2 分离病毒

5.2.2 动物回归试验

5.2.3 组织病理学观察

5.2.4 琼脂免疫扩散试验

5.2.4.1 琼脂板的制备

5.2.4.2 病料处理

5.2.4.3 琼扩试验步骤

5.2.5 间接荧光抗体法对分离株抗原的检测

5.2.6 电镜观察

5.2.7 IBDV 与MDV、CAV、REV 共感染的检测

5.2.7.1 病料的处理

5.2.7.2 IBDV与MDV、CAV、REV 的检测

5.3 结果

5.3.1 发病鸡的临床症状及流行病学

5.3.2 病毒分离结果

5.3.3 琼脂扩散试验

5.3.4 动物回归试验结果

5.3.5 组织病理学观察

5.3.6 电镜观察结果

5.3.7 荧光显微镜观察结果

5.3.8 共感染检测的结果

5.4 讨论

第六章 4个传染性法氏囊病病毒分离株的致病性研究

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.1.1 毒株

6.1.1.2 SPF 鸡胚、SPF 鸡

6.1.2 方法

6.1.2.1 各毒株的处理

6.1.2.3 鸡只的人工感染试验

6.1.2.4 病理组织学观察

6.2 结果

6.2.1 人工接种鸡胚的结果

6.2.2 4个IBDV野毒株对SPF鸡的致病性

6.2.3 组织病理学观察结果

6.2.4 IBDV对中枢免疫器官的作用

6.3 讨论

第七章 传染性法氏囊病病毒4个野毒株VP2基因高变区的克隆与序列分析

7.1 材料

7.1.1 病毒

7.1.2 菌种

7.1.3 试剂

7.1.4 溶液配制

7.1.4.1 DEPC-H20

7.1.4.2 100mg/mL 氨苄霉素

7.1.4.3 X-gal

7.1.4.4 LB 培养液(基)

7.1.4.5 SOB 培养基

7.1.4.6 SOC 培养基

7.2 方法

7.2.1 4 个野毒株原代毒核酸 RNA 的提取

7.2.2 VP2 高变区的扩增

7.2.2.1 引物的设计与合成

7.2.2.2 RT-PCR

7.2.2.3 Nested-PCR

7.2.2.4 PCR 扩增鉴定

7.2.3 PCR 产物的回收

7.2.4 VP2 高变区的克隆与鉴定

7.2.4.1 PCR 产物与pMD18-T vector 的连接

7.2.4.2 感受态细胞的制备——氯化钙法

7.2.4.3 连接产物的转化

7.2.5 重组质粒的提取与鉴定

7.2.5.1 SDS 碱裂解法小量提取质粒

7.2.5.2 重组质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定

7.2.5.3 重组质粒的双酶切鉴定

7.2.6 阳性质粒测序与序列分析

7.3 结果

7.3.1 RT-PCR 结果

7.3.2 目的基因的克隆和测序

7.3.2.1 重组质粒的酶切鉴定

7.3.2.2 序列分析

7.4 讨论

第八章 MTT 比色法在IBDV 分离中的应用

8.1 材料

8.1.1 法氏囊病料

8.1.2 MTT 溶液

8.1.3 裂解液

8.1.4 DMEM

8.1.5 犊牛血清

8.1.6 SPF 鸡法氏囊浸出液

8.1.7 法氏囊提取液

8.1.8 鸡胚浸出液

8.1.9 主要仪器设备

8.2 方法

8.2.1 鸡胚成纤维细胞的制备

8.3 结果

8.4 讨论

第九章 IBDV超强毒株的传代致弱

9.1 材料与方法

9.1.1 病毒

9.1.2 SPF鸡胚和SPF鸡

9.1.3 试剂

9.1.4 溶液配制

9.1.4.1 细胞生长液和细胞维持液

9.1.4.2 Hank’s 液

9.1.5 鸡胚成纤维细胞的制备

9.1.6 病毒的传代

9.1.7 原始囊毒及不同代次细胞毒致病性的测定

9.1.8 细胞适应毒的遗传稳定性试验

9.1.9 弱毒株的免疫原性试验

9.1.10 VP2高变区扩增

9.1.11 序列测定和比较

9.2 结果

9.2.1 病毒的传代驯化

9.2.2 原始囊毒及不同代次细胞毒病毒致病性实验

9.2.3 致弱株的稳定性试验

9.2.4 致弱株的免疫原性和最佳免疫剂量

9.2.5 RT-PCR 产物及重组质粒的酶切鉴定

9.2.6 序列分析

9.3 讨论

9.4 小结

第十章 IBDV细胞苗免疫效果的研究

10.1 材料与方法

10.1.1 实验材料

10.1.2 实验分组

10.1.3 母源抗体水平和免疫后抗体效价的检测

10.1.4 计算免疫器官指数及观察病理组织切片

10.1.5 人工感染用毒株及攻毒途径

10.1.6 统计学分析

10.2 结果

10.2.1 母源抗体水平与免疫后的 IBDV 抗体效价

10.2.2 三种疫苗免疫后对免疫器官的影响

10.2.2.1 囊重比与囊指数

10.2.2.2 免疫器官的组织损伤

10.2.3 不同代次细胞毒对攻毒的免疫保护作用

10.2.4 对新城疫疫苗免疫应答的免疫抑制

10.3 讨论

结论

参考文献

缩略语英汉对照表

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

• [1].狂犬病野毒株全基因组序列分析及分子进化研究[D]. 赵云蛟.吉林农业大学2006
• [2].我国近年来马立克氏病病毒野毒株分子流行病学和生物学特性的研究[D]. 张志.山东农业大学2004
• [3].我国鸡马立克氏病毒流行毒株生物学特性分析[D]. 张艳萍.东北农业大学2015
• [4].马立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物学活性的比较研究[D]. 孙爱军.山东农业大学2009
• [5].犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究[D]. 刘玉秀.吉林大学2014
• [6].野毒株狂犬病毒逃避树突状细胞识别的机制[D]. 杨洋.华中农业大学2014
• [7].副粘病毒HN糖蛋白功能性关键氨基酸定位与促细胞融合机制研究[D]. 褚福禄.山东大学2013
• [8].Characterizing The Function of Bovine Herpesvirus 1 UL51 Protein in Viral Capsid Envelopment, De-envelopment and Secondary Envelopment[D]. SOHAIL RAZA.华中农业大学2016
• [9].新城疫病毒地方株分子流行病学调查及其疫病控制[D]. 程相朝.南京农业大学2003

相关论文

• [1].传染性法氏囊病病毒基因免疫的研究[D]. 李建荣.浙江大学2002
• [2].鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究[D]. 王笑梅.东北农业大学2002
• [3].鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较[D]. 朱瑞良.扬州大学2003
• [4].传染性法氏囊病病毒对CEF细胞某些基因表达的影响和传染性喉气管炎病毒的重组[D]. 李义平.中国农业大学2004
• [5].鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建[D]. 刘红梅.扬州大学2005
• [6].传染性法氏囊病病毒VP5缺失减毒株的构建[D]. 李龙.浙江大学2006
• [7].河南省传染性法氏囊病分子流行病学调查及其防制[D]. 李银聚.南京农业大学2005
• [8].传染性法氏囊B87株全长cDNA的克隆及反向遗传系统的初步建立[D]. 刘锴.吉林大学2007
• [9].鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐.中国农业科学院2007
• [10].我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究[D]. 宇文延青.中国农业科学院2008

标签：传染性法氏囊病病毒论文;  基因高变区论文;  致弱论文;  分子机理论文;  比色法论文;