共轭亚麻酸的分析、代谢和功能研究

论文摘要

近年来,研究报导共轭亚麻酸（CLNA）具有细胞毒性、抑制癌症形成和改变脂代谢等一系列功能,以及其在体内能转化为共轭亚油酸（CLA）,这引起了人们对CLNA研究的极大兴趣。本学位论文对（CLNA）最主要的两种异构体：α-桐酸（c9,t11.t13-CLNA）和石榴酸（c9,t11.c13-CLNA）分析、代谢和功能进行了一系列研究。优化了CLNA甲酯化的程序,以此优化建立的程序对我国天然种质资源进行了分析；证实了CLNA能在大鼠、小鼠和人体内代谢转化为c9.tl1-CLA,在小鼠内α-桐酸的代谢转化率显著高于石榴酸；进一步发现CLNA能降低小鼠肝脏甘油三酯含量,影响小鼠各组织器官脂肪酸组成,显著升高人体8-异前列腺素F2α水平第一部分共轭亚麻酸的分析与资源研究通过对不同的催化方法进行比较,优化了CLNA甲酯化的程序。对不同的含有CLNA的脂类样本通过气相色谱进行定量分析时,应该根据CLNA的化学形式选择合适的甲酯化方法。对自由脂肪酸含量低的脂质甲酯化时直接采用碱性催化的方法（0.5N甲醇钠甲醇溶液55℃反应20min）进行,而对自由脂肪酸含量高的复杂脂质可以采用先皂化裂解（0.3N氢氧化钾90%乙醇溶液37℃皂化裂解2h）,再采用酸性催化的方法（1N硫酸甲醇溶液50℃反应10min）进行甲酯化。以此优化建立的气相色谱分析方法,对我国天然种质资源进行分析,结果表明栝楼、石榴和苦瓜籽油等富含CLNA。栝楼籽油CLNA总含量达36.9%,其中最主要的异构体为石榴酸,含量达32.6%。对三个不同品种的石榴籽进行分析,结果表明石榴籽油中石榴酸含量达73.4%-77.5%,CLNA总含量达83.4%-87.9%。对六个不同品种的苦瓜籽进行分析,结果表明苦瓜籽油中主要含有α-桐酸,含量达56.0%-63.7%,CLNA总含量达65.2%-71.9%。以氯仿：甲醇（2∶1）和石油醚两种溶剂系统萃取栝楼籽油,对其脂质组成和脂质各组分脂肪酸组成等进行了分析。结果表明甘油三酯是栝楼籽油的最主要的脂质组分（95.8-98.4%）,总脂中最主要的脂肪酸是亚油酸（32.7-32.7%）和石榴酸（32.6%-33.3%）。栝楼籽油甘油三酯组分的脂肪酸组成与总脂非常相似,而磷脂脂肪酸组成与总脂之间存在显著差异,磷脂组分石榴酸含量（2.4-9.4%）显著低于总脂（32.6%-33.3%）。不同提取方法磷脂脂肪酸组成也存在显著的不同。第二部分共轭亚麻酸在动物和人体内的代谢通过以2g含有石榴酸的栝楼籽油给SD大鼠灌胃,调查石榴酸在大鼠血浆和各组织器官中24h内的代谢和整合状况。代谢物通过HPLC、GC-MS鉴定和分析,结果表明石榴酸能整合到大鼠血浆和不同的组织器官中,部分石榴酸在血浆、肝脏、肾脏、脑、心脏和脂肪等组织器官中快速地转化为c9,t11-CLA；肝脏和血浆中石榴酸和CLA的浓度高于脑、心脏、肾脏和脂肪组织。以对照日粮、含有1%α-桐酸和1%石榴酸的日粮饲喂ICR小鼠6周（n=8）,比较研究α-桐酸和石榴酸代谢为c9,t11-CLA的代谢转化效率。在α-桐酸和石榴酸饲喂的小鼠各组织器官中,通过GC-MS鉴定得到同一代谢产物c9,t11-CLA。α-桐酸的转化率在所有的小鼠组织器官中均显著高于石榴酸。α-桐酸和石榴酸代谢转化率也存在组织器官间的差异：α-桐酸在脂肪组织、肾脏和脾脏的转化率最大,而在心脏中最低；石榴酸在肝脏的转化率最大,在心脏中的转换率最低。这些结果表明,与大鼠一样在小鼠体内也存在α-桐酸和石榴酸代谢为c9,t11-CLA的△13-双键饱和反应：△13位双键的几何构型可能影响酶的活性,α-桐酸和石榴酸代谢转化率的差异可能是由于△13位双键饱和酶底物特异性选择的结果。采取平行对照实验,招募30个健康青年人（年龄21-35岁,男性24人,女性6人）,以葵花籽油作为安慰剂,以我国特殊的天然资源栝楼籽研究石榴酸在人体内的代谢和整合状况。结果表明石榴酸能整合到人体血浆和红细胞膜中,部分石榴酸能在人体内代谢转化为c9,t11-CLA。石榴酸在人体血浆中代谢转化为c9,t11-CLA的效率为34%,在人体红细胞膜中代谢转化为c9,tl1-CLA的效率为28%。据我们所知,这是首个发现CLNA能在人体内整合和代谢为c9,t11-CLA的研究。这表明在大鼠、小鼠和人体内均存在CLNA转化为c9,t11-CLA的△13-双键饱和反应,但具体的代谢机制还需进一步研究。第三部分共轭亚麻酸功能研究以对照日粮,含1%CLA、1%α-桐酸、1%石榴酸和1%α-亚麻酸的日粮饲喂ICR小鼠6周,比较调查CLA、α-桐酸和石榴酸以及α-亚麻酸对动物体脂、血脂和肝脂等功能的影响（n=8）。α-桐酸、石榴酸和α-亚麻酸饲喂,小鼠体重和内脏脂肪量没有显著变化,而CLA饲喂小鼠内脏脂肪量显著降低。CLA、α-桐酸和石榴酸饲喂对小鼠血脂等也没有显著影响,但α-桐酸和石榴酸能显著降低肝脏甘油三酯的含量。这表明,α-桐酸和石榴酸可能对抑制甘油三酯在肝脏内集聚具有积极的作用。以对照日粮,含1%CLA、1%α-桐酸和1%石榴酸的日粮饲喂ICR小鼠6周,比较研究CLNA和CLA对小鼠各组织器官脂肪酸的影响（n=8）。在心脏和脂肪组织中,饲喂CLA、α-桐酸和石榴酸小鼠18:2n-6的含量均显著降低,相应地各组小鼠脂肪组织n-6多不饱和脂肪酸（n-6 PUFA）和PUFA含量显著降低。石榴酸饲喂,肝脏、肾脏和心脏中22:6n-3含量显著升高,相应地石榴酸饲喂肝脏、肾脏和心脏n-3 PUFA含量显著增加,石榴酸可能通过提高22:6n-3和n-3 PUFA含量而间接起有利的生理功能；而CLA饲喂后肝脏和肾脏中22:6n-3含量显著下降。饲喂CLA后,肝脏、肾脏20:4n-6含量显著下降,而饲喂CLNA后,各组织器官20:4n-6含量没有显著变化。这些结果表明虽然α-桐酸和石榴酸结构相似,但它们对小鼠组织器官脂肪酸组成的作用存在不同；CLNA在小鼠体内可能通过代谢物（CLA）或底物状态（CLNA）单独影响组织器官脂肪酸组成。采取平行对照实验,招募30个健康青年人（年龄21-35岁,男性24人,女性6人）,以葵花籽油作为安慰剂,研究石榴酸对人体血脂、炎症因子和脂质过氧化等的影响。据我们所知,这是首个调查CLNA对人体功能的研究。结果表明,以含3g/d石榴酸的栝楼籽干预4周,对血脂、载脂蛋白和炎症因子等均没有显著影响,而显著升高尿液8-异前列腺素F2α水平。石榴酸有可能通过本身整合到人体内或通过代谢物c9,t11-CLA而起升高8-异前列腺素F2α水平的作用,但其具体的机制还不清楚。石榴酸诱导脂质过氧化水平升高的机制以及可能产生的影响还需要进一步研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酸与人体健康
• 1.2 共轭亚油酸
• 1.2.1 共轭亚油酸的概念和来源发现
• 1.2.2 CLA的异构体
• 1.2.3 共轭亚油酸的合成
• 1.2.3.1 瘤胃生物氢化作用合成
• 1.2.3.2 内源合成
• 1.2.3.3 人工合成
• 1.2.4 共轭亚油酸的代谢和整合
• 1.2.5 共轭亚油酸的功能
• 1.2.5.1 CLA对体脂、体重的影响
• 1.2.5.2 CLA对脂类代谢的影响
• 1.3 共轭亚麻酸
• 1.3.1 共轭亚麻酸的概念、种类和来源
• 1.3.2 共轭亚麻酸的制备
• 1.3.2.1 天然植物资源提取
• 1.3.2.2 化学合成法
• 1.3.2.3 基因工程法
• 1.3.3 共轭亚麻酸的细胞毒性作用
• 1.3.4 共轭亚麻酸的抗癌作用
• 1.3.5 共轭亚麻酸对身体组成和脂类代谢的影响
• 1.4 立题依据、研究目的意义和内容
• 2 共轭亚麻酸甲酯化方法比较研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 栝楼籽油的提取
• 2.1.3 共轭亚麻酸甘油三酯甲酯化方法
• 2.1.3.1 碱催化法
• 2.1.3.2 硫酸甲醇催化法
• 3甲醇催化法'>2.1.3.3 BF₃甲醇催化法
• 2.1.3.4 甲酯过滤
• 2.1.4 共轭亚麻酸的自由脂肪酸形式甲酯化
• 2.1.4.1 油脂皂化和自由脂肪酸的制取
• 2.1.4.2 甲酯化
• 2.1.5 气相色谱分析
• 2.1.6 薄层层析分析甲酯化的完成情况
• 2.2 结果
• 2.2.1 共轭亚麻酸甘油三酯甲酯化
• 3甲醇催化甲酯化'>2.2.2 BF₃甲醇催化甲酯化
• 2.2.3 碱法催化甲酯化
• 2.2.4 共轭亚麻酸自由脂肪酸形式的甲酯化
• 2.3 讨论和结论
• 3 天然植物资源共轭亚麻酸的含量分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 总脂的提取和总脂含量测定
• 3.1.2.1 总脂提取
• 3.1.2.2 含油量测定
• 3.1.3 棒状薄层色谱分析脂类组成
• 3.1.4 气相色谱分析
• 3.1.5 统计分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.3 小结
• 4 富含共轭亚麻酸的栝楼籽油的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 总脂提取和总脂含量测定
• 4.1.3 棒状薄层色谱分析脂质组成
• 4.1.4 薄层层析分离甘油三酯和磷脂
• 4.1.5 脂肪酸组成分析
• 4.1.6 统计分析
• 4.2 结果与讨论
• 4.3 小结
• 5 石榴酸在大鼠体内的代谢和整合
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验动物与处理
• 5.1.3 脂肪提取和脂肪酸分析
• 5.1.3.1 提取
• 5.1.3.2 甲酯化
• 5.1.3.3 脂肪酸甲酯纯化
• 5.1.3.4 气相色谱分析
• 5.1.4 HPLC分析脂肪酸甲酯
• 5.1.5 处理后12h大鼠肝脏脂肪酸甲酯GC-MS分析
• +-TLC分离脂肪酸甲酯'>5.1.6 Ag⁺-TLC分离脂肪酸甲酯
• 5.1.7 脂肪酸DMOX衍生物的制备
• 5.1.8 脂肪酸DMOX衍生物的GC-MS分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 血浆和组织器官脂肪酸分析
• 5.2.2 血浆和组织器官HPLC分析
• 5.2.3 GC-MS分析
• 5.2.3.1 大鼠处理后12h肝脏脂肪甲酯GC-MS分析
• 5.2.3.2 大鼠处理后12h肝脏脂肪DMOX衍生物GC-MS分析
• 5.2.4 石榴酸的代谢和整合状况
• 5.3 讨论与分析
• 6 a-桐酸与石榴酸代谢效率的比较研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 动物、日粮和实验设计
• 6.1.3 脂肪提取和脂肪酸分析
• 6.1.3.1 提取
• 6.1.3.2 甲酯化
• 6.1.3.3 脂肪酸甲酯纯化
• 6.1.3.4 GC分析
• +-TLC分离脂肪酸甲酯'>6.1.4 Ag⁺-TLC分离脂肪酸甲酯
• 6.1.5 脂肪酸DMOX衍生物的制备
• 6.1.6 脂肪酸DMOX衍生物的GC-MS分析
• 6.1.7 石榴酸和α-桐酸代谢转化率的计算
• 6.1.8 统计分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 体重和摄食量
• 6.2.2 石榴酸和α-桐酸的代谢和整合
• 6.2.3 石榴酸和α-桐酸代谢转化率的比较
• 6.3 讨论
• 7 石榴酸在人体内代谢转化为CLA
• 7.1 参与者与研究方法
• 7.1.1 参与者
• 7.1.2 试验的设计
• 7.1.3 样本收集
• 7.1.4 脂肪酸提取
• 7.1.5 甲酯化
• 7.1.6 脂肪酸甲酯纯化
• 7.1.7 GC分析
• 7.1.8 转化率估计
• 7.2 实验结果
• 7.3 讨论与分析
• 8 共轭亚麻酸对小鼠体脂和脂代谢的影响
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 动物、日粮和实验设计
• 8.1.3 材料取集
• 8.1.4 血脂和血糖等生化参数测定
• 8.1.4.1 血浆总胆固醇含量测定
• 8.1.4.2 血浆甘油三酯含量测定
• 8.1.4.3 血浆高密度脂蛋白胆固醇测定
• 8.1.4.4 血浆低密度脂蛋白胆固醇测定
• 8.1.4.5 血浆葡萄糖测定
• 8.1.5 肝脏脂肪的测定
• 8.1.5.1 肝脏胆固醇的测定
• 8.1.5.2 肝脏甘油三酯的测定
• 8.1.5.3 肝脏磷脂的测定
• 8.1.6 统计分析
• 8.2 实验结果
• 8.2.1 体重、摄食量和组织器官重量
• 8.2.2 血脂、血糖和肝脂的影响
• 8.3 讨论
• 8.3.1 共轭亚麻酸与共轭亚油酸对小鼠体脂的影响
• 8.3.2 共轭亚麻酸对血脂和肝脂等的影响
• 9 共轭亚麻酸和共轭亚油酸对小鼠组织脂肪酸组成的影响
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 动物、日粮和实验设计
• 9.1.3 脂肪提取和脂肪酸分析
• 9.1.3.1 提取
• 9.1.3.2 甲酯化
• 9.1.3.3 脂肪酸甲酯纯化
• 9.1.3.4 GC分析
• 9.1.4 统计分析
• 9.2 结果
• 9.3 讨论
• 10 共轭亚麻酸对健康青年人血脂、炎症因子和脂质过氧化的影响
• 10.1 实验材料
• 10.1.1 参与者
• 10.1.2 试验的设计
• 10.1.2.1 试验样本的收集
• 10.1.3 实验室样本分析
• 10.1.3.1 总胆固醇含量测定
• 10.1.3.2 甘油三酯含量测定
• 10.1.3.3 高密度脂蛋白胆固醇测定
• 10.1.3.4 低密度脂蛋白胆固醇测定
• 10.1.3.5 载脂蛋白A1和B测定
• 10.1.3.6 自由脂肪酸测定
• 10.1.3.7 胰岛素测定
• 10.1.3.8 血浆葡萄糖测定
• 10.1.3.9 C反应蛋白测定
• 10.1.3.10 白细胞介素6测定
• 10.1.3.11 尿液肌酐含量测定
• 10.1.3.12 8-异前列腺素F2α测定 #1]2
• 10.1.4 统计分析
• 10.2 实验结果
• 10.2.1 参与者基本情况和完成情况
• 10.2.2 共轭亚麻酸对体重和BMI的影响
• 10.2.3 共轭亚麻酸对血脂和脂蛋白的影响
• 10.2.5 共轭亚麻酸对炎症介质的影响
• 01.2.6 共轭亚麻酸对8-异前列腺素F2.的影响
• 10.3 讨论与分析
• 10.3.1 石榴酸对人体血脂的影响
• 10.3.2 石榴酸对人体炎症相关参数的影响
• 10.3.3 石榴酸对人体脂质过氧化物的影响
• 11 结论与展望
• 11.1 主要结论
• 11.2 展望
• 参考文献
• 作者简历