乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的研究

论文摘要

食品中农药残留一直是人们关注的热点问题,有机磷类农药抑制人体血液和组织中胆碱酯酶的活性,导致食品安全事件经常发生。建立一种准确快速、简单廉价的农药残留检测技术是食品安全和环境保护的当务之急。本文对鲫鱼脑中乙酰胆碱酯酶的提取、纯化工艺进行了优化,对已纯化的AChE活性影响因素进行了优化,对所得乙酰胆碱酯酶进行了固定化及荧光生物传感器制备研究。以鲫鱼头为原料,采用匀浆辅助Tris-Hcl浸提法提取乙酰胆碱酯酶（AChE）,以响应面分析方法优化提取工艺,得到AChE最佳提取条件:Tris-Hcl的浓度0.069mol/L,pH8.09,料液比6.28:1（mL/g）,匀浆时间7.1min（每15s间隔5s）,得出最大酶的比活力为158.25U/mg。粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-200凝胶色谱纯化得到酶的比活力为343.98U/mg,纯化2.17倍,经SDS-PAGE电泳呈现两条带,其纯度接近电泳纯。用酶的底物特异性和过量底物抑制作用分析已纯化酶为AChE。对已纯化的AChE活性影响因素进行了优化,最佳活性测定条件:底物（碘代硫化乙酰胆碱）浓度3.5mmol/L、缓冲液pH值8.0、温度35℃,恒温时间15min,得到最佳酶的比活力为414.91U/mg。通过壳聚糖、硝酸纤维素、木耳多糖三种载体吸附-交联法固定化AChE,比较固定化酶活力和活力回收率,确定了壳聚糖吸附-交联法固定化AChE为最佳方案。经正交实验优化得出最佳固定化条件:壳聚糖浓度0.2g/ml,给酶量70μl/cm2,在4℃下吸附12h,浓度为0.4%的戊二醛,4℃下交联2h,得到固定化酶膜的活力和酶膜回收率分别为6.46U/cm2和44.25%。本文还对固定化酶荧光传感器检测有机磷农药O,O-二甲基-（2,2,2-三氯-1-羟基乙基）磷酸酯（敌百虫、trichlorfon）进行了研究。以异硫氰酸荧光素（FITC）为指示剂,抑制时间15min,Trichlorfon浓度1.5×10-41.5×10-8M内与荧光强度呈线性关系,计算出回归方程为lgIv=0.0353lgc+3.3743,相关系数为0.9971,最低检出限（LDC）为1.5×10-8M。图谱重现性良好,峰高相对标准偏差（RSD）为0.2516%,实现了Trichlorfon残留的快速检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 国内外研究现状及分析
• 1.2.1 乙酰胆碱酯酶的提取纯化
• 1.2.2 乙酰胆碱酯酶的功能、结构及水解机理
• 1.2.3 乙酰胆碱酯酶固定化研究现状
• 1.2.4 Trichlorfon农药特性及残留标准
• 1.2.5 荧光生物传感器的研究现状
• 1.3 本课题的研究目的及意义
• 1.4 本课题主要研究内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验测定方法
• 2.2.2 实验材料的确定
• 2.2.3 鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶提取工艺研究
• 2.2.4 鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶的纯化
• 2.2.5 已纯化的AChE纯度检测
• 2.2.6 已纯化的AChE活性测定条件单因素优化实验
• 2.2.7 已纯化的AChE的固定化
• 2.2.8 壳聚糖膜为载体固定化酶与游离酶的比较
• 2.2.9 荧光生物传感器的研究
• 第3章 乙酰胆碱酯酶的分离纯化研究
• 3.1 Tris-HC1 浸提条件确定
• 3.1.1 Tris-HC1 浸提单因素实验
• 3.1.2 Tris-HC1 浸提响应面优化实验
• 3.2 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 3.3 硫酸铵分级盐析纯化AChE效果分析
• 3.4 凝胶层析纯化AChE效果分析
• 3.5 已纯化的乙酰胆碱酯酶纯度检测
• 3.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.5.2 已纯化的AChE特异性分析和抑制性作用
• 3.6 已纯化的AChE活性测定条件单因素实验
• 3.6.1 活性测定体系pH值对AChE活力影响
• 3.6.2 活性测定体系底物浓度对AChE活力影响
• 3.6.3 活性测定体系温度对AChE活力影响
• 3.6.4 活性测定体系保温时间对AChE活力影响
• 3.7 本章小结
• 第4章 固定化乙酰胆碱酯酶膜的制备
• 4.1 AChE固定化方法和载体筛选
• 4.1.1 AChE固定化方法筛选
• 4.1.2 AChE固定化载体筛选
• 4.2 壳聚糖吸附-交联法固定化AChE单因素实验
• 4.2.1 壳聚糖浓度对固定化酶活力的影响
• 4.2.2 吸附时间对固定化酶活力的影响
• 4.2.3 吸附温度对固定化酶活力的影响
• 4.2.4 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响
• 4.2.5 戊二醛交联时间对固定化酶活力的影响
• 4.2.6 戊二醛交联温度对固定化酶活力的影响
• 4.2.7 给酶量对固定化酶活力的影响
• 4.3 壳聚糖吸附-交联法固定化AChE正交优化实验
• 4.4 壳聚糖膜为载体固定化酶与游离酶的比较
• 4.4.1 固定化酶和游离酶的最适pH值比较
• 4.4.2 固定化酶和游离酶的温度稳定性比较
• 4.4.3 固定化酶和游离酶的动力学模型的比较
• 4.4.4 固定化酶和游离酶保存特性的比较
• 4.5 本章小结
• 第5章 乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的研究
• 5.1 固定化酶反应体系最佳激发波长确定
• 5.2 最佳激发波长相对标准偏差确定
• 5.3 最小二乘法拟合和最低检测限确定
• 5.4 荧光传感器重现性
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢