三株植物内生真菌次级代谢产物的研究

论文摘要

植物内生菌是具有高度多样性的微生物资源,代谢产物多种多样,包括杀虫、抗菌、抗肿瘤等活性物质,是目前人们寻找新型抗菌、抗肿瘤天然药物的重要资源。本研究利用上海来益生物药物研究开发中心的植物内生菌资源,通过抗肿瘤和抗菌模型的筛选,在获得的活性菌株中,对其中的3株进行了菌种鉴定,并对它们的次级代谢产物进行分离、纯化及活性研究。主要研究工作包括以下几个方面:对1280株植物内生真菌进行了筛选,经模型初筛、复筛,共获得28份具有高且稳定的抗肿瘤活性的菌株发酵样品,8份具有较强抗菌活力的菌株发酵样品,选取其中3株抗肿瘤活性菌株HCCB1614、HCCB1778及HCCB2310进一步研究。根据菌株的形态、培养特征、18S rDNA以及ITS序列分析结果,对活性菌株HCCB1614、HCCB1778及HCCB2310进行菌种鉴定,结果分别鉴定为拟茎点霉属、链格孢霉属以及扁棒壳菌属。对菌株HCCB1778的代谢产物进行研究,分离纯化得到5个次级代谢产物,分别为HCCB1778-15。利用质谱和核磁共振波谱对这些产物进行结构鉴定,确定HCCB1778-1为6,8-二甲基-四氮奈-2,4（3H,10H）二酮,分子量242;HCCB1778-2为4’,7-二羟基异黄酮,分子量254;HCCB1778-3为4’,5,7-三羟基异黄酮,分子量270,对A549、LoVo细胞均具有很强的抑制作用,其中HCCB1778-3对LoVo细胞的抑制率最高,可达78.95%,目前HCCB1778-3已经开发为药物;HCCB1778-4为链格孢毒素（Altertoxin-I）,分子量为352,具有较强的诱变作用和一定的抑制血小板聚集的作用;HCCB1778-5（新化合物）化学命名为1,4,9,12-四羟基-1,2,12,12a-四氢苝-3,10（11H,12bH）-二酮,为HCCB01778-4同系物,分子量352,是首次分离得到的新化合物,具有一定的抗肿瘤活性。对菌株HCCB2310次级代谢产物的分离研究得到两个化合物,分别为3,22,24-三羟基-齐果墩烷-12-烯和琥珀酸。为了快速分离得到菌株HCCB1614活性成分,本研究利用传统方法和高速逆流色谱法结合对其活性代谢产物进行了分离。选取两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1:3:3:3）,体系上相为固定相,下相为流动相。成功地从内生真菌HCCB1614的次级代谢物中快速分离得到一细胞毒活性组分。经高效液相色谱分析,其纯度为99%以上。其化学结构由1H-NMR和13C-NMR鉴定确认为Cytochalasin N。从菌株HCCB1778次级代谢产物中分离得到的Altertoxin I （ATX I）是一种链格孢霉菌产生的真菌毒素,一直被认为是一种重要的食品和粮食的污染物。最近研究表明Altertoxin I具有很好的抗凝血作用,能够阻止血小板聚集,IC50为29μM,因此具备作为药物开发的潜力。为了得到足够量的Altertoxin I用于进一步的研究和开发,本研究首次建立了一种利用高速逆流色谱一次性分离制备ATX I的方法。实验利用溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:5:5:6）对发酵产物的萃取物进行分离,利用HPLC分析以及质谱和核磁共振波谱对目标产物进行鉴定。结果表明该方法每次可以分离得到毫克级的目标产物。本研究从18L发酵产物中共分离得到45mg AXT I,纯度可以达到95%以上。因此该方法将为以后AXT I的快速分离制备提供有效的帮助。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 天然产物的重要性
• 1.1 传统药物在新药发现中的作用
• 1.2 天然产物来源药物的研究进展
• 1.2.1 来源于陆生植物的天然药物研究进展
• 1.2.2 2000-2005 年间陆生微生物来源药物的研究进展
• 1.2.3 来源于海洋生物的药物
• 1.2.4 来源于陆地脊椎动物和无脊椎动物药物的研究进展
• 1.3 天然药物研究的发展趋势
• 1.3.1 发现未知结构
• 1.3.2 前体结构的优化
• 1.3.3 旧化合物新的给药途径
• 2 药用植物内生真菌的研究进展
• 2.1 植物内生菌的定义
• 2.2 内生菌宿主植物的选择
• 2.3 来源于内生真菌天然产物的研究进展
• 2.3.1 抗菌活性物质
• 2.3.2 抗肿瘤活性物质
• 3 立题依据
• 4 研究方案
• 第二章 植物内生真菌活性菌株的筛选
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要实验仪器与设备
• 1.4 主要培养基
• 1.5 肿瘤细胞系
• 1.6 抗菌模型指示菌株
• 2 方法
• 2.1 筛选样品的制备
• 2.1.1 菌种的纯化
• 2.1.2 筛选样品的制备
• 2.2 菌株发酵样品的筛选模型
• 2.2.1 抗肿瘤细胞筛选模型
• 2.2.2 抗菌筛选模型
• 3 结果与讨论
• 3.1 筛选样品制备结果
• 3.2 抗肿瘤细胞模型活性菌株初筛结果
• 3.3 抗肿瘤细胞模型活性菌株复筛结果
• 3.4 抗菌模型筛选结果
• 4 本章小结
• 第三章 活性菌株的鉴定、生理生化特性及发酵条件的考察
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 斜面培养基
• 1.3 生理生化测定培养基
• 1.4 发酵培养基
• 1.5 主要试剂
• 1.6 仪器设备
• 2 方法
• 2.1 菌株的形态学鉴定
• 2.1.1 菌株培养特征的变化
• 2.1.2 菌株的生理生化特性
• 2.1.3 菌株显微特征的观察
• 2.2 菌株的分子鉴定
• 2.2.1 染色体DNA 的提取
• 2.2.2 PCR 扩增引物的合成
• 2.2.3 18S rDNA 和 ITS 序列 PCR 扩增体系
• 2.2.4 PCR 扩增条件
• 2.2.5 系统发育分析
• 2.3 活性菌株发酵物的稳定性研究
• 2.4 活性菌株的培养基选择试验
• 2.5 活性菌株发酵时间的考察
• 3 结果与讨论
• 3.1 菌株的形态、培养特征
• 3.2 菌株的生理生化特性
• 3.3 不同方法对总DNA 制备的影响
• 3.4 染色体DNA 的制备及18S rDNA 和ITS 序列的PCR 实验
• 3.5 活性菌株的系统发育分析及鉴定结果
• 3.6 活性菌株的发酵物质稳定性试验
• 3.7 不同发酵培养基对活性菌株产活性物质的影响
• 3.8 发酵时间对菌株活性的影响
• 4 本章小结
• 第四章 活性菌株HCCB1778 和HCCB2310 代谢产物的分离及结构解析
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 样品制备
• 2.1.1 种子制备和发酵培养
• 2.1.2 活性检测方法
• 2.2 薄层层析法（TLC）的探索
• 2.2.1 显色方法的探索
• 2.2.2 展开体系的探索
• 2.3 产物组分的分离
• 2.4 样品的理化性质及化学结构解析
• 5 对肿瘤细胞的体外抑制实验'>2.5 化合物HCCB1778-1⁵对肿瘤细胞的体外抑制实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 TLC 检测及柱层析条件的确定
• 3.2 菌株HCCB1778 代谢产物的研究
• 3.2.1 化合物HCCB1778-1 的结构鉴定
• 3.2.2 化合物HCCB1778-2 的结构鉴定
• 3.2.3 化合物HCCB1778-3 的结构鉴定
• 3.2.4 化合物HCCB1778-4 的结构鉴定
• 3.2.5 化合物HCCB1778-5 的结构鉴定
• 3.3 菌株HCCB2310 代谢产物的研究
• 3.3.1 化合物HCCB2310-1 的分离与结构鉴定
• 3.3.2 化合物HCCB2310-2 的分离与结构鉴定
• 3.4 体外抗肿瘤活性测定
• 4 本章小结
• 第五章 利用高速逆流色谱对活性菌株HCCB1614 活性物质的分离
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂和材料
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 菌种来源
• 1.2.3 细胞及检测方法
• 1.2.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 活性位点的确定
• 2.2 HSCCC 样品的准备和处理
• 2.3 两相体系的选择和准备
• 2.4 固定相保留率的测定
• 2.5 分离过程
• 2.6 样品的分析和鉴定
• 2.7 活性样品对肿瘤细胞的体外抑制实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 薄层活性位点的确定
• 3.2 活性样品HSCCC 分离
• 3.3 活性化合物Fa4 的结构鉴定
• 3.4 化合物Fa4 对多种肿瘤细胞的体外抑制活性
• 4 本章小结
• 第六章 利用高速逆流色谱对ATX I 的制备分离
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 培养基的优化
• 2.2 K 值测定
• 2.3 样品制备和分离
• 2.4 ATX I 的HPLC 检测条件
• 3 结果与讨论
• 3.1 菌株HCCB1778 发酵条件优化
• 3.1.1 碳源试验
• 3.1.2 氮源试验
• 3.1.3 均匀设计试验
• 3.2 HSCCC 实验
• 3.2.1 溶剂体系的选择和优化
• 3.2.2 HSCCC 分离
• 3.3 ATX I 产率及结构鉴定
• 4 本章小结
• 全文总结
• 1 主要结论
• 2 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表或录用的论文