论文摘要
原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）是生殖母细胞的前体细胞,是精子或卵子的祖先细胞,其作为一种多能干细胞,具有与胚胎干细胞相似的形态及分化潜能,能在体外进行培养、传代,并在一定条件下保持未分化的二倍体状态及其多能性,具有形成嵌合体动物的能力。本研究采用EDTA-酶解法提取发育至第19期和第28期鸡胚胎性腺中的PGCs,经过体外培养、传代后,利用不同特异性化学物质分别对第3代PGCs进行体外定向诱导,以此探讨PGCs体外诱导分化的最优条件。另外,本实验初步探索通过显微注射法将供体鸡胚PGCs注射至受体鸡胚,从而制备嵌合体鸡的方法。本研究实验数据将为PGCs用于基因组学研究、药物筛选等提供有价值的参考依据。研究结果如下:1.以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为诱导剂,诱导PGCs向成骨细胞分化,比较以上各种诱导剂不同浓度和不同组合形成的诱导液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,均能诱导产生成骨细胞,其诱导率为47%～79%。其中,诱导剂Ⅰ和诱导剂Ⅱ诱导分化的效果最好,两者之间无显著差异（P>0.05）,但极显著高于诱导剂Ⅲ、Ⅳ（P<0.01）,而诱导剂Ⅲ和诱导剂Ⅳ之间也存在极显著差异（P<0.01）。在使用同一种诱导分化剂的情况下,两个时期PGCs的诱导分化率差异不显著（P>0.05）。诱导21d后细胞经碱性磷酸酶（ALP）染色、钙结节Von Kossa’s染色鉴定、免疫化学染色检测I型胶原（CollagenⅠ）表达,均呈强阳性,说明诱导后细胞是成骨细胞。2.以地塞米松、胰岛素、IBMX为诱导剂,诱导PGCs向脂肪细胞分化,比较以上各种诱导剂不同浓度和不同组合形成的诱导液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,除诱导剂Ⅴ外,均能诱导产生75%～89%的脂肪细胞。其中,诱导剂Ⅰ+Ⅴ的诱导分化效果最好,与诱导剂Ⅰ、Ⅱ差异极显著（P<0.01）。此外,诱导剂Ⅰ、Ⅱ两者之间差异不显著（P>0.05）,但是PGCs加入诱导剂Ⅰ后出现脂肪细胞的时间较诱导剂Ⅱ早1～2天。诱导剂Ⅲ、Ⅳ的脂肪细胞诱导效果无显著差异（P>0.05）,但与诱导剂Ⅰ、Ⅱ以及Ⅰ+Ⅴ存在极显著差异（P<0.01）;诱导剂Ⅴ的诱导分化率仅为1%～2%,与其他各组差异极显著（P<0.01）。在使用同一种诱导分化剂的情况下,两个时期PGCs的诱导分化率差异不显著（P>0.05）。诱导21d后细胞经油红O染色为橙红色;此外,根据PPAR-γ基因设计一对引物,预扩增301bp的片段,诱导后的细胞经RT-PCR验证,出现目的条带,说明诱导后细胞中有PPAR-γ表达,证明鸡PGCs在体外诱导分化后具有明确的向脂肪细胞分化的能力。3.以维甲酸、IBMX为诱导剂,诱导PGCs向神经元样细胞分化,比较以上各种诱导剂不同浓度和不同组合形成的诱导液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,均能诱导PGCs产生75%～87%的神经元样细胞。诱导剂Ⅰ、Ⅱ诱导分化的效果最好,两者之间无显著差异（P>0.05）,但与诱导剂Ⅲ之间差异极显著（P<0.01）。由此可见,RA、IBMX的单独使用对神经元样细胞的形成率极显著高于RA与IBMX联合使用的效果。在使用同一种诱导分化剂的情况下,两个时期PGCs的诱导分化率差异不显著（P>0.05）。诱导4d后细胞行甲苯胺蓝染色,可见蓝紫色的尼氏体。免疫组化法检测诱导后细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达,结果为NSE与NF呈阳性,GFAP呈阴性,证明PGCs定向诱导分化为神经元样细胞。4.本研究分别将供体（黑羽乌骨鸡）PGCs显微注射移植到40只受体（苏禽黄鸡）种蛋的鸡胚胚下腔中,仅有2只孵化至18 d,但是未呈现出表型嵌合,即羽色嵌合;3只孵化至15 d,均呈现出羽色嵌合,嵌合率为7.5%;孵化至5～10 d不等的有6～8只。在孵化至15 d的3只嵌合体鸡胚中,黑色羽毛出现的部位和面积大小各不相同。黑色羽毛有的位于头部,有的位于背部,而且面积也大小不一。说明利用PGCs可以制备嵌合体,但是本实验未得到嵌合体活鸡,因此制备嵌合体鸡仍需进一步探索研究。