大鼠皮质原代星形胶质细胞液压冲击损伤前后蛋白质组学研究

论文摘要

目的:建立体外培养星形胶质细胞液压冲击损伤模型,观察星形胶质细胞液压冲击前后形态学改变和研究蛋白质组表达变化情况,寻找差异性蛋白标志物。方法:选新生24小时内SD大鼠,取皮质组织,经第一次纯化传代后培养8-10天,随机分为对照组及损伤后12h、24h和48h组,复制Scott’s细胞液压冲击损伤模型,进行细胞形态学观察。采用双向凝胶电泳技术分析星形胶质细胞液压冲击损伤后不同时间点蛋白质组表达的改变。结果:1星形胶质细胞培养和纯化:我们采用SD大鼠皮质原代培养胶质细胞进行研究,以模拟脑外伤时胶质细胞蛋白质组学的变化。新生的SD大鼠,分离皮质,剥除脑膜,置于盐平衡液,剪碎,弯管轻轻吹打分散细胞,过网筛,差速粘附去除成纤维细胞。混合培养至第9-12天待细胞融合后,置于37℃摇床中,200r/min 14-16h,以去除少突胶质细胞和小胶质细胞。然后用0.25%胰蛋白酶消化传代,接种于直径为60mm培养皿中,接种密度为0.8×105/ml,得到纯化的星形胶质细胞。采用GFAP抗体免疫组化（SP法）染色鉴定,通过计数,检查培养纯度。结果显示培养的胶质细胞纯度达到95%以上。继续培养7-8天,生长状态良好,铺满瓶底,形成大致均一的扁平细胞层。此时的星形胶质细胞状态稳定,可以进行冲压损伤实验。2体外培养细胞液压冲击损伤装置稳定性评价:液压冲击损伤模型所产生压力的大小,通过记录小室内和有机玻璃管内的压力大小来反映。实验证明,小室内和有机管内的压力差别很大,两者间存在一线性关系:Y=4.4763X+0.2986,Y为有机玻璃管内压力,X为小室内压力。通过连接两个压力传感器,分别测量在不同冲击角度下两处压力的大小,造成细胞损伤力的大小以小室内的压力为准。有机管和小室内压力随钟摆打击角度的增加而增大。3液压冲击损伤星形胶质细胞形态学改变:随机将细胞分为对照、0.05MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.4MPa、0.8MPa冲击压力组,损伤后换全液,半小时后在培养液中加入0.4%台盼蓝1ml,混匀,光镜下观察。星形胶质细胞随着冲击压力的不断升高,依次发生了肿胀、细胞连接断开、皱缩、脱壁、小片状脱壁、消融等显著损伤坏死后形态学改变。冲压损伤后PI/Hoechst33342（1:1）荧光双染后,发现星形胶质细胞随着冲击压力的不断升高死亡细胞比率有增高趋势,而且在0.2MPa冲击压力组观察到细胞凋亡。但是当压力达到0.8MPa冲击压力后,死亡细胞数显著下降,考虑是坏死损伤细胞已经发生快速消融。结合前部分实验,得出0.2MPa可以造成星形胶质细胞中度损伤。随机将细胞分为对照组,2h、4h、8h、12h、24h、48h组,分别给予0.2MPa冲击压力后,换全液,分别在2h、4h、8h、12h、24h、48h,加入1ml 0.4%台盼蓝,混匀,光镜下观察。在0.2MPa中重度冲击压力损伤后,星形胶质细胞随时间发生变圆、细胞连接断开、皱缩、脱壁、胞膜破裂、恢复等显著的形态学改变。光镜下观察,损伤最严重发生在2、4小时,到8、12小时细胞状态趋于稳定,开始恢复了,到24、48小时已与对照组基本相同。4大鼠皮质原代星形胶质细胞液压冲击损伤前后差异蛋白质谱分析:各组检测到的总蛋白点数,对照组1179±89,12h组1279±113,24h组1233±73,48h组1256±132。损伤后共有32个蛋白质点的相对强度与手术对照组相比有显著性差异（P<0.05）,其中24个蛋白点与对照组相比在损伤组表达升高,有8个蛋白质点与对照组相比在损伤组表达下降。结论:1体外培养星形胶质细胞液压冲击伤后引起形态学改变。2体外星形胶质细胞受损严重程度随压力增大而增高,损伤后形态学改变有一定的时间依从性。3液压冲击损伤能导致星形胶质细胞蛋白质组发生变化。4在损伤后各个时间点检测到的差异性蛋白,可能是脑损伤后特异性表达的生物标志蛋白,采用双向电泳和生物质谱方法,从蛋白分子水平对其损伤机制进行深入了解和研究,对于脑损伤的临床应用诊断和治疗具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
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• 研究论文 大鼠皮质原代星形胶质细胞液压冲击损伤前后蛋白质组学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 缺血缺氧损伤下星形胶质细胞pH 调节机制
• 致谢
• 个人简历