Bordetella sp.菌株1-3顺式环氧琥珀酸水解酶的研究

论文摘要

D（-）-酒石酸是一种非常重要的四碳手性源,在制药工业上主要用作手性拆分剂,在食品工业中,也可用作酸味剂或防腐剂。但目前尚未发现天然存在的D（-）-酒石酸,用化学拆分等方法生产D（-）-酒石酸,存在工艺复杂、成本高、对环境污染严重等缺点。由于生物转化具有高效性、高选择性、反应条件温和、对环境友好等优点,使其成为生产D（-）-酒石酸的理想替代途径。顺式环氧琥珀酸水解酶（CESH）可以水解顺式环氧琥珀酸,生成D（-）-酒石酸。但是目前关于该酶的报道较少,仅见于日本的两个专利。本研究从土壤中分离筛选到一株可以用于生物转化生产D（-）-酒石酸的菌株,并对其进行了系统的分类学鉴定。将该菌株固定化后转化底物顺式环氧琥珀酸,成功得到了D（-）-酒石酸。随后研究了该菌株产CESH的发酵条件,对该酶进行了纯化并研究其酶性质。最后对该酶基因进行了克隆,并在大肠杆菌中进行了高效表达。主要实验结果如下:1.菌株的筛选分离及鉴定经过富集培养划线分离纯化后,得到了一株能够生产D（-）-酒石酸的菌株,通过对该菌株的形态学研究,生理生化测定,16S rDNA测序和系统发育分析,确定菌株1-3属于博德特菌属（Bordetella sp.）。2.固定化细胞进行生物转化的研究用凝胶包埋法固定菌株1-3的细胞,生物转化底物顺式环氧琥珀酸。将转化产物进行纯化之后,得到无色透明的晶体。用红外光谱、核磁共振和旋光测定法对晶体进行鉴定,结果显示转化产物为D（-）-酒石酸。3.菌株产酶发酵条件的研究采用响应面的优化方法,以菌体生长量和酶活为指标,确定该菌株产CESH的最优条件。结果显示,最优培养基组成为:酵母膏7.8g/L、顺式环氧琥珀酸9.8g/L、KH2PO41.12g/L、K2HPO4·3H2O3g/L、MgSO4·7H2O 0.625g/L、微量元素溶液12.5mL/L、pH 7.0;最适培养条件为:培养温度30℃、装液量为75mL（500mL三角烧瓶）,120rpm培养30h;最终发酵液的酶活可达9.27U/mL。4.酶的纯化和性质研究在发酵罐中培养10升菌液,离心收集,沉淀经超声波破壁后得到粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Toyopearl HW-65C疏水层析、Sephadex G-75分子筛层析后,纯度提高约177倍,比活达到50U/mg。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示为单一条带,分子量约为33kD。研究CESH的特性得知:该酶反应的最适pH为7.0;最适作用温度为45℃;在pH5.0～10.0、55℃以下稳定;对顺式环氧琥珀酸的Km值为10mmoL/L;Hg2+、EDTA和临菲罗磷几乎使该酶完全失活;该酶活性中心有Zn2+的存在。5.顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆与表达采用PCR扩增得到了菌株1-3顺式环氧琥珀酸水解酶的基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pET-15b中,最后将重组质粒转入大肠杆菌进行高效表达。结果显示:大肠杆菌重组CESH的产量比野生菌的产量提高七十倍以上。对重组酶特性进行研究后发现,其pH稳定性为5.0～9.0,略窄于原始酶,其它性质无明显变化。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物催化
• 1.1.1 生物催化技术的核心--生物催化剂
• 1.1.2 生物催化反应的类型
• 1.1.3 生物催化的发展策略与前景
• 1.2 环氧化物水解酶
• 1.2.1 环氧化物水解酶的作用机制
• 1.2.2 各种来源的环氧化物水解酶
• 1.2.2.1 哺乳动物环氧化物水解酶
• 1.2.2.2 植物的环氧化物水解酶
• 1.2.2.3 微生物中的环氧化物水解酶
• 1.3 手性化合物研究进展
• 1.4 酒石酸的研究概况
• 1.4.1 L（+）-酒石酸的研究概况
• 1.4.2 D（-）-酒石酸的研究概况
• 1.5 本研究的目的及内容
• 第二章 产D（-）-酒石酸菌株的分离及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株的分离源
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 富集
• 2.2.2 菌株的分离纯化
• 2.2.3 酶活的测定
• 2.2.4 菌株1-3的鉴定
• 2.2.4.1 细菌的形态观察
• 2.2.4.2 生理生化鉴定
• 2.2.4.3 DNA G+C含量测定
• 2.2.4.4 16S rDNA序列测定
• 2.2.4.5 基于16S rDNA序列的系统发育分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产D（-）-酒石酸菌株的筛选
• 2.3.2 菌株1-3的鉴定
• 2.3.2.1 形态学研究
• 2.3.2.2 菌株1-3的生理生化特性
• 2.3.2.3 菌株1-3的DNA G+C含量测定
• 2.3.2.4 菌株1-3的16S rDNA序列测定及系统发育分析
• 2.4 结论
• 第三章 固定化细胞生产D（-）-酒石酸的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 试剂及培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞固定化及生物转化
• 3.2.2 转化产物的纯化
• 3.2.3 纯化产物的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 细胞固定化及生物转化
• 3.3.2 转化产物的鉴定
• 3.4 结论
• 第四章 菌株1-3产酶发酵条件的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 试剂及培养基
• 4.1.3 培养条件
• 4.2 单因素实验方法产酶发酵条件的研究
• 4.2.1 不同氮源对菌株1-3产酶的影响
• 4.2.2 不同碳源对菌株1-3产酶的影响
• 4.2.3 单因素实验方法对所选氮源最佳浓度的确定
• 4.2.4 不同诱导物对菌株1-3产酶的影响
• 4.2.5 单因素实验方法对碳源及诱导物最佳浓度的确定
• 4.2.6 单因素的实验方法确定培养基的最佳起始pH
• 4.2.7 10升发酵罐发酵菌株1-3的研究
• 4.3 响应面的方法确定菌株1-3的产酶发酵条件
• 4.3.1 Plackett-Burman设计优化菌株1-3培养基及培养条件
• 4.3.2 最陡坡的实验设计
• 4.3.3 中心组合旋转设计
• 4.3.4 验证实验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 不同氮源对菌株1-3产酶的影响
• 4.4.2 不同碳源对菌株1-3产酶的影响
• 4.4.3 碳源浓度对菌株1-3产酶的影响
• 4.4.4 不同诱导物对菌株1-3产酶的影响
• 4.4.5 不同的起始pH对菌株1-3产酶的影响
• 4.4.6 10升发酵罐对菌株1-3发酵产酶的研究结果
• 4.4.7 Plackett-Burman设计的实验结果
• 4.4.8 最陡坡试验设计的结果
• 4.4.9 中心组合旋转设计和响应面分析
• 4.4.10 最佳培养条件的验证实验
• 4.5 结论
• 第五章 酶的纯化及其性质研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 材料及试剂
• 5.1.2 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 主要方法
• 5.2.2 纯化步骤
• 5.2.2.1 粗酶液的制备
• 5.2.2.2 硫酸铵分级沉淀
• 5.2.2.3 离子交换层析
• 5.2.2.4 疏水层析
• 5.2.2.5 分子筛层析
• 5.2.3 酶性质的研究
• 5.2.3.1 酶的纯度及分子量的测定
• 5.2.3.2 酶的最适反应温度及其热稳定性
• 5.2.3.4 酶的最适反应pH及其pH稳定性
• 5.2.3.5 各种金属离子及化学试剂对酶活的影响
• 5.2.3.6 酶促反应动力学研究
• 5.2.3.7 酶的N端氨基酸序列和酶活性中心的离子
• 5.3 结果及分析
• 5.3.1 顺式环氧琥珀酸水解酶的纯化结果
• 5.3.1.1 硫酸铵分级沉淀
• 5.3.1.2 DEAE-Cellulose离子交换层析
• 5.3.1.3 Toyopearl HW-65C疏水层析
• 5.3.1.4 Sephadex G-75分子筛层析
• 5.3.1.5 顺式环氧琥珀酸水解酶的提纯结果
• 5.3.2 顺式环氧琥珀酸水解酶的性质
• 5.3.2.1 顺式环氧琥珀酸水解酶的分子量
• 5.3.2.2 酶的最适作用温度与热稳定性
• 5.3.2.3 酶的最适反应pH与pH稳定性
• 5.3.2.4 各种金属离子及化学试剂对酶活的影响
• 5.3.2.5 酶促反应动力学研究
• 5.3.2.6 N端氨基酸序列的测定
• 5.4 结论
• 第六章 顺式环氧琥珀酸水解酶基因的克隆与表达
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌种和载体
• 6.1.2 工具酶及试剂盒
• 6.1.3 其它试剂
• 6.1.4 常用培养基和缓冲液
• 6.1.5 常用仪器
• 6.2 一般方法
• 6.2.1 基因组DNA的提取
• 6.2.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 6.2.3 小批量快速抽提质粒DNA
• 6.2.4 感受态细胞的制备
• 6.2.5 目的基因片断的胶回收
• 6.2.6 连接反应
• 6.2.7 质粒DNA的转化
• 6.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 6.3 具体方法
• 6.3.1 DNA的提取
• 6.3.2 PCR扩增
• 6.3.3 限制性内切酶双酶切及纯化
• 6.3.4 连接及转化
• 6.3.5 转化子的挑选及鉴定
• 6.3.6 BL21的转化及诱导表达
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 菌株1-3基因组的提取及PCR扩增
• 6.4.2 重组质粒的构建
• 6.4.3 DH5α的转化与重组载体的鉴定
• 6.4.4 E.coli.BL21感受态细胞的转化及诱导表达
• 6.5 结论
• 第七章 重组顺式环氧琥珀酸水解酶的纯化及性质的研究
• 7.1 材料
• 7.1.1 材料及试剂
• 7.1.2 培养基及缓冲液
• 7.1.3 主要仪器
• 7.2 方法
• 7.2.1 菌体的大量培养
• 7.2.2 重组酶的纯化
• 7.2.3 重组蛋白的酶性质研究
• 7.2.3.1 重组蛋白分子量的确定
• 7.2.3.2 最适pH及pH稳定性
• 7.2.3.3 最适反应温度及热稳定性
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 重组酶的纯化
• 7.3.2 重组酶的最适反应pH及pH稳定性
• 7.3.3 重组酶的最适反应温度及热稳定性
• 7.4 结论
• 第八章 结论与展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 论文创新点
• 8.3 展望
• 参考文献
• 作者简介