论文摘要
繁殖性状是一个重要的经济性状,其中产仔性能是影响生产效率的最主要因素,受多基因控制,具有加性-显性基因作用模式,其遗传力很低,牛的群体双胎遗传力和排卵遗传力分别为0.03和0.07。目前普遍的方法是通过一些实践技术（如激素诱导、激素免疫和胚胎移植等）提高双胎率,但其存在遗传选择进展慢,手段繁琐、成本高等一系列问题,所以借助分子生物技术手段来提高产仔数是人们研究的另一个方向。公牛的精液品质是影响母牛受胎率及种公牛利用效率的重要因素,也是影响生产效益的关键因素。克隆精液品质相关基因并探讨其相关功能,这对于揭示动物繁殖性状调控机制及加快动物育种进展有重要作用。因此,本研究利用生物信息学和分子生物学相关技术,选取了与精液品质有关的ACTN1、Dmrt7、Mina53、Trf2、Tbxa2r、CyclinA1、GDNF和CIB1共8个基因作为候选基因,进行cDNA克隆、组织表达谱和SNPs检测及与母牛产仔数性状关联分析,为进一步研究这些基因与种公牛精液品质奠定了理论基础。取得了以下结果:基因的cDNA克隆方面1.利用EST拼接和GenScan技术,结合RT-PCR方法,得到了牛ACTN1、Dmrt7、Mina53、Trf2、Tbxa2r、CyclinA1、GDNF和CIB1共8个候选基因完整的CDS区序列并进行了生物信息学分析。2.通过3’RACE的方法,得到了牛Dmrt7基因完整的3’UTR区序列。向GenBank数据库递交了ACTN1、Dmrt7和Trf2基因的cDNA序列,分别获取登录号EF512630、EF534775和EU140625。组织表达方面3.用RT-PCR的方法对其中的5个候选基因在肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、脾脏、心脏、脂肪、卵巢、肾脏和肌肉共12个组织中的表达情况进行了研究,结果发现,除Dmrt7基因只在睾丸组织中表达外,其余4个基因都有比较广泛的组织表达。4.以SYBR Green I与dsDNA结合后检测荧光强度的方法进行定量。对在睾丸组织中表达量比较高的Trf2和Mina53基因在肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、脾脏、心脏、脂肪、卵巢、肾脏和肌肉共12个组织中表达情况进行了研究。结果发现,Trf2基因在睾丸组织中表达量最高,其次是肝脏和子宫,表达最低的是胃和脾脏。Mina53在睾丸组织中表达最高,其次是肝脏和子宫,表达最低的是卵巢。SNPs检测及关联分析方面5.采用PCR-SSCP方法和测序的方法对Dmrt7基因第1内含子、第2外显子和第2内含子;第4内含子、第5外显子和第5内含子;第7内含子,第8外显子和第8内含子进行了SNP扫描,发现在牛Dmrt7基因第2内含子存在G/A和A/T、第4内含子存在C/G和C/T、第7内含子存在C/G共5个单碱基突变位点。在鲁西单胎牛,西门塔尔牛,水牛,晋南牛和海福特牛群体中,对该基因的第4内含子的C/G突变的分布情况进行了研究,结果发现:CC基因型个体在群体中占绝对优势;在水牛和西门塔尔牛群体中没有发现多态现象,其他3个群体均处于中度多态。6.采用PCR-RFLP方法和测序的方法对ACTN1基因的第8外显子和第9内含子,第9外显子和第10内含子,第10外显子和第11内含子,第12外显子和第13内含子,第14外显子和第15内含子进行SNPs扫描,发现在牛ACTN1基因的第9内含子存在G/A,第10内含子存在A/G和G/A,第11内含子存在G/C,13内含子存在A/G,在第15内含子存在G/A和A/G共7个单碱基突变位点。以下是对6个地方品种（鲁西单胎牛,鲁西双胎牛,南阳牛,晋南牛,中国西门塔尔牛和荷斯坦牛群体）的群体进行检测多态性并且运用SAS 9.1软件,采用GLM对其基因多态性与产犊数进行了最小二乘均值差异显著性检验。对第10内含子的A/G突变位点用ApaⅠ限制性内切酶在6个群体中进行群体遗传学分析及其与产犊数进行关联分析。结果表明:所有群体在该位点都处于低度多态。在内含子10的ApaⅠ酶切位点,AG基因型的产犊数的最小二乘均数极显著（P<0.01）高于基因型GG基因型。用HaeⅢ限制性内切酶对13内含子的A/G突变位点在6个群体中进行群体遗传学分析及关联分析。结果表明:在内含子13的HaeⅢ酶切位点,AA基因型个体与AG基因型个体间的产犊数差异不显著（P>0.05）。对第15内含子的G/A突变用RsaⅠ限制性内切酶在6个群体中进行群体遗传学分析及其与产犊数进行了关联分析。结果表明:所有群体在该位点都处于中度多态。在内含子15的RsaⅠ酶切位点,产犊数性状在3种基因型间的差异均不显著（P>0.05）。Dmrt7基因原核表达7.对在睾丸组织中惟一表达的Dmrt7基因进行构建了Dmrt7基因的pET28a+原核表达载体,并成功地实现了对Dmrt7蛋白的融合表达。探讨其对雄性发育的重要作用。