论文摘要
研究背景恶性肿瘤是危害人类生命的重大疾病,近几年来发病率一直在持续上升,如何克服肿瘤这个难关成为人们研究的热点。手术、放疗和化疗作为传统的三大治疗方法,虽然对肿廇有一定的治疗作用,但是仍存在很多的不足：如放疗和化疗缺乏肿瘤特异性,对正常组织细胞损伤大,毒副作用大,复发率高,不能从本质上根治肿瘤等。因此,寻找高效无毒副作用,能够诱导长期免疫保护作用,防止术后复发的的新疗法及新型药物成为临床肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。目前肿瘤治疗的难点是肿瘤术后的高复发率,如何才能预防或降低复发率成为人们研究的重点。肿瘤的生物治疗在动物实验和临床试验中显示了巨大的潜力,被认为是继手术、放疗、化疗之后,对肿瘤具有确切效果的又一治疗方法。它主要包括肿瘤特异性主动免疫治疗、抗体靶向治疗、细胞因子治疗、过继细胞免疫治疗和基因治疗,而细胞因子在肿瘤生物治疗中应用非常广泛。细胞因子是由免疫细胞分泌的一大类的蛋白、多肽和糖蛋白,它能够调节机体免疫反应,增强淋巴细胞对肿瘤的杀伤,从而达到抑制肿瘤生长的目的,被广泛应用于临床肿瘤疾病的治疗。由于全身用药量大,会产生严重的毒副作用,因此临床上多采用局部用药。但是因为组织的弥散作用,代谢较快,病灶周围细胞因子在局部不能达到有效浓度并较长时间的维持,因此限制了其抗肿瘤的效果。链亲和素（SA）,是由Streptomyces avidinii菌分泌的的一种非糖基化的蛋白质,每个SA分子可以结合4个生物素分子。生物素又称维生素H,细胞表面蛋白质的氨基易生物素化,而生物素化对机体和细胞无明显毒副作用。基于链亲和素与生物素化的分子快速且几乎不可逆的强力结合,以及生物素较容易渗入各种生物分子的特性,我们建立了一个新的技术平台——蛋白质锚定技术,即将链亲和素标记的细胞因子锚定在已经生物素化的肿瘤细胞表面,从而制成了肿瘤疫苗。先用生物素化试剂将生物素化学交联到肿瘤细胞或组织表面的膜蛋白上,然后将链亲和素标记的目标蛋白即双功能分子借助链亲和素与生物素的特异结合将目标蛋白锚定在肿瘤细胞膜或肿瘤组织表面,其中生物素化反应对细胞、组织和机体无明显的不良作用,这种技术可以使融合蛋白在体内对肿瘤组织进行快速原位修饰,迅速永久地固定在肿瘤病灶及其周围,固定的量可以进行精确的控制,可持续维持细胞因子在肿瘤细胞膜上及其肿瘤组织中的有效治疗浓度,并避免大量细胞因子进入循环系统引起的严重的毒副作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种造血生长因子和免疫调节因子,由多种类型细胞产生,包括巨噬细胞、内皮细胞、肥大细胞以及活化的CD4+.CD8+细胞。它是一种能够强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子,还能够增加主要组织相容性复合物、共刺激分子的表达并增强树突状细胞的抗肿瘤能力。它通过促进抗原提呈来建立固有免疫和适应性免疫之间的联系,进而增强特异性免疫应答。本室先前的实验表明：链亲和素标记的鼠GM-CSF融合蛋白制成的肿瘤疫苗在鼠的浅表膀胱癌以及前列腺癌动物模型中,有效缓解了细胞因子的降解,维持了细胞因子的浓度,起到了很好的抗肿瘤效应。但是由于人和鼠具有种系差异性,因此,对人的GM-CSF需要做进一步的研究。本文构建了SA/hGM-CSF原核表达质粒,在大肠杆菌中实现了高效表达,对SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的纯化与复性进行了研究,并对其双功能活性进行了初步鉴定,为以后SA/hGM-CSF双功能融合蛋白在临床抗肿瘤的大量应用奠定了基础。研究目的构建SA/hGM-CSF重组表达质粒,表达纯化SA/hGM-CSF双功能融合蛋白,并研究其生物学功能。研究方法1.构建SA/hGM-CSF重组表达质粒应用PCR方法扩增hGM-CSF目的片段,产物经双酶切并纯化回收,然后与本室保存的pET24a-SA载体连接。获得pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA原核表达质粒,经菌落PCR及双酶切初步鉴定后,送公司测序以充分验证基因框架的正确。2. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的表达纯化探索出SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的最佳诱导条件（诱导时间,诱导温度等）。大量扩增细菌并收集菌体,通过12%SDS-PAGE凝胶来确定融合蛋白是在包涵体还是在上清中表达。在包涵体表达的蛋白纯化之前需要在变性剂（如盐酸胍,尿素等）的作用下,充分溶解。由于融合蛋白带有His标签,因此利用Ni-NTA填料来纯化蛋白。利用不同浓度的咪唑磷酸盐缓冲液,从低浓度到高浓度依次洗脱蛋白,收集洗脱峰,经12%SDS-PAGE凝胶鉴定,目的蛋白在何种浓度的咪唑磷酸盐缓冲液中被洗脱下来。3. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的复性SA/hGM-CSF双功能融合蛋白在尿素体系中采用梯度稀释法复性,逐渐降低尿素浓度。复性过程中形成中间体和多聚体是蛋白质复性的最大问题所在,中间体阻碍作用大,蛋白质正确折叠困难,复性就困难。降低蛋白质的浓度可以减少中间体的形成并且提高复性效率。在蛋白质中加入50mmol/L的β-巯基乙醇,以充分打开蛋白质的二硫键。为了促使二硫键的形成,在复性液中加入了还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽,提高蛋白的复性率。4.SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的进一步纯化利用DEAE-SepharoseFF对复性后SA/hGM-CSF融合蛋白进行离子交换层析纯化,利用不同浓度的NaCl的Tris-HCl缓冲液,从低浓度到高浓度依次洗脱蛋白,收集洗脱峰,经12%SDS-PAGE凝胶鉴定,目的蛋白在何种浓度的NaCl的Tris-HCl缓冲液中被洗脱下来。5. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的Western Blotting鉴定10%SDS-PAGE电泳分离蛋白,利用半干电转仪将蛋白转移至PVDF膜上。用5%的脱脂奶粉于37℃封闭3h后,加入1：2000封闭液稀释的鼠抗人GM-CSF单克隆抗体4℃孵育12h,TBST洗涤3次,加入偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠IgG二抗（1：5000稀释）37℃孵育1h,TBST洗涤后用ECL曝光。6. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的活性鉴定hGM-CSF可以在体外促进人红白血病细胞的增殖,利用体外促人红白血病细胞增殖法检测融合蛋白的活性,并与标准品比较活性是否有差异。通过与标准品的比较获得所制备的SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的活性单位。7.流式细胞仪检测（?）SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的锚定率生物素化肿瘤细胞,将SA/hGM-CSF融合蛋白锚定到已生物素化的肿瘤细胞表面,加入鼠抗人GM-CSF单克隆抗体（一抗）,充分反应后,加入FITC标记的羊抗鼠IgG（二抗）,充分洗涤后,上机检测,分析SA/hGM-CSF对肿瘤细胞的锚定修饰结果。研究结果1.成功构建pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重组质粒。重组质粒进行DNA测序,结果与GenBank收录的SA和和hGM-CSF序列完全一致,基因读码框架正确。2.将测序正确的质粒转化大肠杆菌Rosetta,经筛选获得表达工程菌,培养后在37℃,IPTG诱导4h,目的蛋白的表达量占总蛋白表达量的20%,主要以包涵体形式表达。包涵体首先用6mol/L盐酸胍溶解,在盐酸胍完全溶解后再用6mol/L尿素磷酸盐缓冲液稀释10倍,提高融合蛋白回收率。经洗涤后,融合蛋白的纯度达到65%,镍金属螯合层析后,经12%SDS-PAGE凝胶鉴定,SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA两种融合蛋白分别在30mmol/L、50mmol/L咪唑浓度洗脱下来,纯度达到91%。3.复性后SA/hGM-CSF双功能融合蛋白主要以多聚体的形式存在,且复性过程中形成的沉淀较少。4.复性后的融合蛋白用DEAE-Seperose层析柱纯化,分别用30mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、500mmol/L、1mmol/L NaCl洗脱液洗脱蛋白。SA/hGM-CSF双功能融合蛋白在200mmol/L NaCl浓度洗脱下来,纯度达到96%。5. Western Blotting结果证明SA/hGM-CSF双功能融合蛋白单体与多聚体均能与GM-CSF单克隆抗体结合,并发生显色反应。6. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白能够促进人红白血病细胞增殖,呈剂量依赖关系。SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的活性和hGM-CSF标准品无明显差别。经比较分析,发现SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA的生物学活性无明显差别。7.流式细胞仪检测SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA双功能融合蛋白的肿瘤细胞锚定率,锚定率为99.94%、99.98%。研究结论1.成功构建了pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重组表达质粒。2.成功制备了表达量及纯度较高的SA/hGM-CSF双功能融合蛋白。3. SA/hGM-CSF双功能融合蛋白具有链亲和素和hGM-CSF的生物学活性。4. SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA双功能融合蛋白的性质无明显差别。SA/hGM-CSF双功能融合蛋白的研制为开展后续临床研究奠定了基础。