论文摘要
慢加急性肝衰竭是临床常见急危重症之一,病死率很高,其发病机制非常复杂,迄今尚无理想的治疗方法。有研究报道肠源性内毒素血症在肝衰竭发病过程中起重要作用,而高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为晚期炎症介质,参与了内毒素血症发生与发展过程。因此推测HMGB1可能在慢加急性肝衰竭（ACLF）的发病机制中发挥一定作用。本文试图通过体内、体外实验,观察HMGB1拮抗剂正丁酸钠对慢加急性肝衰竭的治疗效果,探讨拮抗HMGB1表达对慢加急性肝衰竭的保护作用及其机制,旨在为临床治疗慢加急性肝衰竭提供理论研究,研究共分为四个部分。第一部分：慢加急性肝衰竭大鼠模型的建立目的：建立稳定的慢加急性肝衰竭大鼠模型。方法：应用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖等药物联合诱导方法,构建ACLF大鼠模型,观察大鼠模型的组织学及病理生理学改变特点。结果：应用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖等药物联合诱导6周,观察结果显示,模型组大鼠的肝组织学检查可见假小叶、广泛肝细胞变性、以及融合性坏死和桥接坏死等典型改变,并伴有肺、肾及肠道粘膜组织的病理损伤,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素y（IFN-y）、 HMGB1等也伴有相应升高,呈现慢加急性肝衰竭的组织学和病理生理学改变特点。结论：该大鼠模型与临床常见的ACLF病理学改变特点相似,稳定性较好。第二部分：正丁酸钠对慢加急性肝衰竭大鼠的保护作用目的：观察正丁酸钠（sodium bucyrate）对大鼠慢加急性肝衰竭的保护作用。方法：应用人血白蛋白、脂多糖及D-氨基半乳糖建立ACLF大鼠模型。实验动物随机分为正常对照组、模型组及正丁酸钠治疗组。治疗组大鼠在诱导ACLF模型后第12h和24h时间点,分别给予正丁酸钠（500mg/kg）治疗。检测血清HMGB1、肿瘤坏死因子α（TNF-a）、干扰素γ（IFN-y）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、及总胆红素（TBIL）水平。观察肝组织病理学变化。检测肝组织中HMGB1mRNA表达及HMGB1蛋白、NF-κB p65蛋白水平。观察正丁酸钠对ACLF大鼠生存时间和生存率的影响。结果：模型组大鼠血清HMGB1、TNF-α、IFN-γ、ALT、AST及TBIL均显著升高,并且呈现严重的肝组织病理学损伤,伴有广泛肝细胞变性坏死。正丁酸钠治疗组不论12h或24h时间点,肝组织学损伤较模型组均显著改善,并且血清HMGB1、TNF-α IFN-γ、 ALT、AST及TBIL水平明显降低,肝组织中HMGB1蛋白及NF-κB p65蛋白表达减少,大鼠生存时间较模型组显著延长（P<0.05）。结论：正丁酸钠通过抑制HMGB1表达,控制NF-κB活性,降低炎症因子水平,减轻肝细胞损伤,提高模型大鼠存活率,提示正丁酸钠有较好的保肝作用。第三部分：正丁酸钠对慢加急性肝衰竭大鼠肠粘膜通透性的影响目的：探讨正丁酸钠对慢加急性肝功能衰竭大鼠肠道粘膜通透性的影响。方法：应用人血白蛋白、脂多糖以及D-氨基半乳糖等药物联合诱导,建立慢加急性肝功能衰竭大鼠模型,并用正丁酸钠进行治疗。观察小肠粘膜病理学改变以及肠道粘膜通透性（FD4）变化。检测血清内毒素（LPS）、D-乳酸（D-lactate）、二胺氧化酶（DAO）、HMGB1、TNF-α、IFN-γ水平。结果：模型组大鼠的肠粘膜损伤程度和肠粘膜通透性明显异常,而经正丁酸钠治疗组,无论在第12h或24h时间点,大鼠的肠道病理损伤均较模型组明显减轻,小肠粘膜通透性（FD4）较模型组降低（P<0.05）。血清内毒素、D-乳酸、DAO、HMGB1、TNF-α和IFN-γ水平也较模型组明显降低（P<0.05）。结论：正丁酸钠能够降低肠道粘膜通透性,降低血清内毒素及炎症因子释放水平,对慢加急性肝衰竭大鼠的肠道粘膜屏障具有保护作用。第四部分：正丁酸钠对Caco-2（?）田胞分泌高迁移率族蛋白B1的影响目的：探讨正丁酸钠对肠粘膜上皮细胞分泌HMGB1的影响及其作用机制。方法：选择Caco-2细胞为研究对象,以U937细胞作为对照,在不同时间点、采用不同剂量脂多糖（LPS）对细胞进行刺激,并应用正丁酸钠进行干预。观察细胞存活率及细胞凋亡变化。检测培养上清中HMGB1蛋白水平及细胞内HMGB1mRNA、HMGB1蛋白以及NF-κB p65蛋白表达水平。观察HMGB1蛋白在肠粘膜上皮细胞内的分泌和移位。结果：应用LPS刺激后,在24h内细胞存活率较高,于48h时间点开始出现明显坏死或凋亡。在24h和48h时间点细胞内有较弱HMGB1mRNA表达。应用LPS刺激后,Caco-2细胞培养上清中于12h时间点检测到HMGB1蛋白,晚于免疫细胞U937细胞（6h）,表达量也低于U937细胞,并且随时间延长而逐渐增加,呈时间依赖性（P<0.05）。经量子点超敏免疫荧光标记后观察发现,在12h时间点,Caco-2细胞内开始出现HMGB1胞浆移位,随时间延长红色荧光逐渐增强。经western blotting证实,在12h时间点,细胞内HMGB1蛋白表达水平开始增加。在24h时间点,细胞内NF-κB p65蛋白表达水平开始增加。应用正丁酸钠拮抗后,Caco-2细胞内及培养上清中HMGB1蛋白水平明显降低,胞浆移位减少（P<0.05）。同时细胞内p65蛋白表达水平也随之下降。结论：肠粘膜上皮细胞Caco-2在LPS刺激下,可以分泌HMGB1,并且分泌时相晚于免疫细胞U937,分泌量也较少。该分泌过程与细胞内HMGB1的胞浆移位有关,且可以被HMGB1拮抗剂正丁酸钠所抑制。提示HMGB1参与了肠粘膜上皮细胞的损伤过程,与LPS诱导的炎症反应密切相关,可能是炎症早期造成肠粘膜通透性升高的原因之一。正丁酸钠可能通过抑制NF-kB通路活性发挥抗炎作用。