蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

论文摘要

目的从海洋生物双齿围沙蚕消化道中筛选高产蛋白酶菌株,对菌株的生物学特征进行系统研究;分离纯化目的蛋白酶并研究其理化性质和酶学特性。方法用奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶株的筛选和蛋白酶活力测定;常规微生物学方法鉴定目的菌株D2,PCR扩增其16S rRNA基因并进行系统发育分析;检测菌株D2在不同温度、生长时间、pH值条件下的产酶能力,优化产酶条件;以48h发酵液上清为材料,经80%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化D2胞外蛋白酶;研究该酶的分子量、等电点、最适作用温度、最适作用pH值、酸碱稳定性和热稳定性,以及金属离子和抑制物等对酶活性的影响,并用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱ESI-MS/MS测定其胰蛋白酶解后的部分氨基酸序列。结果从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选出蛋白酶高产菌株D2（菌株保藏号:CGMCC No.1868）,微生物学鉴定和16S rRNA基因系统发育分析证实其为嗜麦芽窄食单胞菌;该菌革兰氏染色阴性,杆状,菌体1.5～3.0μm×0.5～1.0μm,极生鞭毛1～4根;适宜生长温度22℃～28℃,适宜生长pH 7.0～9.0;产酶能力约156.0 U/mL,最佳产酶条件为pH 7.5、25℃培养48 h;四步法纯化得到电泳纯的D2蛋白酶,纯化倍数4.9,活性回收率33%;目的蛋白酶分子量42.0 kDa,等电点9.97,最适作用温度60℃,最适作用pH为9.0,在pH 6.0～11.0及0～60℃具较好的稳定性;Cu2+、Ca2+、Mg2+、K+等金属离子对酶活力有明显促进作用,EDTA和PMSF则强烈抑制酶活力;该酶对尿素、SDS、DTT等变性剂有较好的耐受性;水解酪蛋白的Km值为2.44 mg/mL;氨基酸N-末端序列测定提示该酶氨基末端可能被修饰,两个内部肽段经质谱测序分别为AHGFLPLTK和APSATGGSALYPLE FVVGK。结论成功筛选出蛋白酶高产菌株D2,其产生的高温碱性丝氨酸蛋白酶具有一定的工业开发价值和应用潜力,有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂和仪器
• 1.4 蛋白酶高产菌株的筛选
• 1.5 蛋白酶高产菌株的鉴定
• 1.6 菌株D2产酶条件的优化
• 1.7 D2蛋白酶性质的初步研究
• 1.8 D2胞外蛋白酶的纯化及性质研究
• 1.9 D2蛋白酶的氨基酸序列测定
• 1.10 D2蛋白酶等电点的测定
• 第二章 结果
• 2.1 蛋白酶高产菌株的筛选和鉴定
• 2.2 菌株D2产酶条件的优化及酶学性质的初步研究
• 2.3 D2蛋白酶的纯化及性质研究
• 第三章 讨论
• 3.1 沙蚕消化道高产蛋白酶菌株D2的筛选及分离鉴定
• 3.2 D2蛋白酶的分离纯化
• 3.3 D2蛋白酶的酶学性质
• 3.4 D2蛋白酶的序列分析
• 第四章 结论和展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 问题与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢