重组可溶性人TRAIL抑制肿瘤细胞增殖的研究

论文摘要

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）,又称凋亡素-2配体（apoptosis receptor 2 ligand, Apo2L）,是1995年发现的肿瘤坏死因子家族的新成员,和其它家族成员一样,同属Ⅱ型跨膜蛋白,由胞浆区（14个aa）,跨膜区（26个aa）和胞膜外区（241个aa）组成,胞膜外区有蛋白酶作用位点,可以从外膜上被剪切下来,形成可溶性分子,也可以形成二/三聚体。 到目前为止,TRAIL的五种受体相继被发现:四种膜受体DR4（死亡受体4）,DR5（死亡受体5）,DCR1（诱骗受体1）,DCR2（诱骗受体2）,和一种可溶性受体OPG。DR4和DR5广泛表达于正常组织细胞和肿瘤细胞,DCR1或DCR2表达于正常组织细胞。由于DCR1和DCR2的膜外区均有两个与DR4和DR5高度同源的富含半胱氨酸的伪重复序列,能够与TRAIL结合,但DCR1胞内没有DD（death domain死亡结构域）,DCR2在胞内有一部分DD,与TRAIL结合后,凋亡信号传递中断,正常细胞可以逃逸TRAIL的凋亡诱导作用;但是肿瘤细胞只表达DR4和DR5,所以TRAIL可以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。 对TRAIL的研究,研究者从最初的全长表达,然后不断进行截短,到目前有些研究者表达了TRAIL的114-281氨基酸。我们根据TRAIL的晶体结构分析得知,114—119位氨基酸是高度无序的,且电子密度缺失。另外,130-160氨基酸形成“AA”环,在与受体结合中发挥重要作用,第230位的Cys对其生物活

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 一.TRAIL的研究进展
• 1.TRAIL及其受体的发现
• 2.TRAIL的分子结构
• 3.TRAIL的受体
• 3.1 TRAIL-R1
• 3.2 TRAIL-R2
• 3.3 TRAIL-R3
• 3.4 TRAIL-R4
• 3.5 OPG
• 4.TRAIL和受体之间的相互作用
• 5.TRAIL诱导凋亡的机制
• 6.机体对TRAIL和TRAILR的表达调控
• 7.与TRAIL凋亡有关的分子
• 8.TRAIL-DR激活的其他信号通路
• 8.1 NFκB信号通路
• 8.2 PI3激酶—AKt信号通路
• 8.3 JNK信号通路
• 9.TRAIL诱导细胞凋亡影响因素
• 10.TRAIL在肿瘤治疗中的应用
• 10.1 TRAIL在肿瘤治疗中的研究现状
• 10.2 增强癌细胞对TRAIL敏感性的策略
• 10.2.1 离子射线的作用
• 10.2.2 抗真菌药的作用
• 10.2.3 化疗药的作用
• 10.2.4 基因毒性药物的作用
• 10.2.5 细胞因子的作用
• 10.2.6 过氧化物酶增生物激活受体—γ的作用
• 二.大肠杆菌表达系统
• 1 表达宿主概述
• 2 表达载体pET系统概述
• 2.1 选择pET载体
• 2.2 表达菌株的选择
• 三.巴斯德毕赤酵母表达系统
• 1 巴斯德毕赤酵母的生物学
• 2 巴斯德毕赤酵母表达载体
• 3 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的外部条件
• 3.1 外源基因特性
• 3.2 启动子的选择
• 3.3 mRNA的非翻译区（UTR）
• 3.4 起始密码子AUG的旁侧序列
• 3.5 表达框的染色体整合位点和方式
• +和Mut^s）'>3.6 宿主菌的甲醇利用表型（Mut⁺和Mut^s）
• 3.7 基因剂量
• 3.8 分泌信号
• 3.9 产物稳定性
• 3.10 翻译后修饰
• 3.11 发酵条件
• 第二章 材料和方法
• 一.原核表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 细菌和细胞培养所用溶液
• 2.1.3 提取总RNA所用的试剂与溶液
• 2.1.4 RT和PCR反应所用的试剂与溶液
• 2.1.5 PCR产物的回收，连接，鉴定所用的试剂与溶液
• 2.1.6 蛋白纯化，鉴定所用的试剂与溶液
• 2.1.7 Western-blot所用的试剂与溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA提取和第一链cDNA的合成
• 2.2.2 引物的合成和PCR反应
• 2.2.3 PCR产物回收与T载体法的连接和转化
• 2.2.3.1 PCR产物回收
• 2.2.3.2 T载体的连接
• 2.2.3.3 感受态细胞的制备
• 2.2.3.4 转化
• 2.2.3.5 碱裂解发提取质粒结果鉴定
• 2.2.3.5.1 收获
• 2.2.3.5.2 碱裂解法
• 2.2.3.5.3 酶切鉴定
• 2.2.4 重组子的筛选和鉴定
• 2.2.4.1 pET30a的酶切
• 2.2.4.2 重组子的构建和鉴定
• 2.2.5 重组蛋白的表达和纯化
• 2.2.5.1 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.5.2 菌体的收获和破碎
• 2.2.5.3 蛋白的纯化
• 2.2.5.4 Western blotting
• 2.2.6 蛋白定量
• 2.2.7 细胞培养
• 2.2.8 MTT试验
• 2.2.8.1 实验原理
• 2.2.8.2 实验步骤
• 2.2.9 PI／Hoechest33258染色检测凋亡细胞
• 2.2.9.1 实验原理
• 2.2.9.2 实验步骤
• 2.2.10 计算机模拟
• 二.毕赤酵母表达
• 2.1 表达载体的构建
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 载体构建
• 2.2 酵母转化
• 2.2.1 溶液
• 2.2.2 方法
• 2.3 筛选
• 2.3.1 筛选多基因整合转化子
• +或Mut^s转化子'>2.3.2 筛选Mut⁺或Mut^s转化子
• 2.4 PCR鉴定整合
• 2.4.1 分离酵母DNA
• 2.4.2 PCR分析
• 2.5 诱导表达
• 第三章 实验结果和讨论
• 3.1 原核表达
• 3.1.1 PCR
• 3.1.2 重组质粒的构建
• 3.1.3 重组蛋白的表达
• 3.1.4 重组蛋白的纯化
• 3.1.5 Western-blotting
• 3.1.6 重组TRAIL蛋白A，B可抑制肿瘤细胞增殖
• 3.1.7 蛋白B可抑制不同的肿瘤细胞增殖
• 3.1.8 计算机模拟
• 3.2 酵母表达
• 3.2.1 PCR
• 3.2.2 重组子的构建
• 3.2.3 酵母表达
• 3.3 讨论
• 研究总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢